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课件网) 第五章：分子生物学研究方法（上） --DNA重组技术 一、DNA重组技术的基本含义 1、基本概念 DNA重组技术也称为基因克隆或分子克隆。最终目的是把一个生物体中的遗传信息（DNA）转入另一个生物体。 2、基本步骤 目的基因的提取:供体生物基因或称外源基因的提取 限制性酶切：获取目的基因 酶接：连接到另一DNA分子上（克隆载体） 转化:将这个重组DNA分子转入受体细胞 筛选和鉴定:对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定 基因表达：进行培养，检测外援基因是否表达。 二、限制性内切酶 1、限制性内切酶的定义 具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列并由此切割DNA双链结构的酶。 2、限制性内切酶的发现 Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染，而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现象叫做限制 － 修饰。 H in d Ⅰ 来源菌的属 种名 株名 分离的序号 HindI 3、限制性内切酶的命名 4、限制性内切酶的特点 识别位点严格专一 识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp 识别位点是一种回文序列的DNA 5、常见的限制性内切酶 限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点 EcoR Ⅰ G↓AATTC Hind Ⅲ A↓AGCTT BsuR I GG↓CC Pst Ⅰ CTGCA↓G Sma Ⅰ CCC↓GGG Xba Ⅰ T↓CTAGA Xho Ⅰ C↓TCGAG BamHⅠ G↓GATCC Not Ⅰ GC↓GGCCGC 6、限制性内切酶的切割方式 在对称轴5' 侧切割产生5' 粘端 在对称轴3' 侧切割产生3' 粘端 在对称轴处切割产生平段 切割方式有三种 5‘ –G A A T T C-3’ EcoRI G A A T T C 5‘ 粘端 3‘ – C T T A A G-5‘ C T T A A G 5‘ – C T C G A G-3’ Pst I C T C G A G 3‘ – G A G C T C-5‘ G A G C T C 3‘ 粘端 5‘ – C C C G G G-3’ Sma I C C C G G G 平末端 3‘ – G G G C C C-5‘ G G G C C C 平末端 5／粘端 5／粘端 3／粘端 粘性末端连接 平末端连接 -AAGCCCGGGTCG- -GGAGGTTAACCT- -TTCGGGCCCAGC- - CCTCCAATTGGA- Sma I酶切 AAGCCC-OH P-GGGTCG- -GGAGGTT-OH P-AACCT- TTCGGG-P OH-CCCAGC- -CCTCCAA-P OH-TTGGA- 混合退火 OH P -GGAGGTT GGGTCG- -CC TCCAA CCCAGC- 7、同尾酶 (Isocaudomers) 有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端。 但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。 MunI： 5` - C A A T T G - 3` 3` - G T T A A C - 5` 5` - C A A T T G - 3` 3` - G T T A A C - 5` EcoRI： 5` - G A A T T C - 3` 3` - C T T A A G - 5` 5` - G A A T T C - 3` 3` - C T T A A G - 5` 重新连接后的序列： 5` - C A A T T C - 3` 3` - G T T A A G - 5` 三、常用的载体 1、质粒载体 2、噬菌体载体 3、考斯质粒(cosmid） ① 能在宿主细胞中自主复制。 ② 容易进入宿主细胞。 ③ 容易插入外来核酸片段。 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化， 便于重组操作。 ⑤ 容易被识别筛选。 载体一般要求 1、质粒载体 质粒（plasmid）是存在于细菌中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（covalently closed circular DNA, ccc DNA） (1) 质粒的生物学特性 自主复制性：携带有自己的复制起始区（ori）能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。 不相容性：不同质粒如果被导入同一细胞中，会彼此竞争，结果在细菌繁殖几代之后，子细胞中绝大多数都含有占优势的一种质粒。 稳定性：在宿主细胞中保持一定的考贝数 寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制 表现型：有不同的表型，如对抗生素的抗性等。 复制类型 严紧型 : 质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制 ... ...
