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课件网) 专题5 DNA和蛋质技术专题整合 提取DNA利用的是DNA、RNA、蛋白质和脂质的理化性质的差异。具体地说，DNA与其他物质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，再通过冷酒精进一步去除其他杂质。另外DNA对高温和洗涤剂的耐受性较高，不易被破坏。鉴定时可采用二苯胺试剂沸水浴加热呈蓝色来判断DNA的存在。 DNA与蛋白质的提取 提取与分离蛋白质是根据蛋白质的分子形状和大小，所带电荷的性质和多少，溶解度、吸附性质以及对其他分子的亲和力等理化性质，将不同种类的蛋白质分离开。凝胶色谱法可以将相对分子质量不同的蛋白质有效分离。 DNA与蛋白质的提取技术比较 电泳法可将带有不同电荷的蛋白质分离。 DNA 血红蛋白 材料 选取 鸡血细胞等DNA含量相对较高的生物组织 哺乳动物的成熟红细胞 细胞 破碎 加蒸馏水、加洗涤剂和食盐搅拌、研磨 加蒸馏水和甲苯充分搅拌 去除 杂质 ①用不同浓度的NaCl溶液处理 ②用酒精溶液处理 ③用蛋白酶处理 ①透析处理 ②纯化处理 鉴定 加入二苯胺，沸水浴 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量 PCR技术与凝胶色谱法的比较 PCR 凝胶色谱法 过程 变性：90 ℃以上高温解旋 ↓ 复性：50 ℃左右引物与单链结合 ↓ 延伸：72 ℃合成子链 凝胶色谱柱的制作 ↓ 装填：凝胶装填均匀，无气泡 ↓ 纯化 酶 需要热稳定性高的TaqDNA聚合酶 不需要酶 温度 高温 常温 DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途 及原理比较 试剂 质量浓度 用途 原理 NaCl 溶液 2 mol/L 溶解 DNA DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在质量浓度为2 mol/L时最大、在质量浓度为0.14 mol/L时最小 0.14 mol/L 析出 DNA 2 mol/L 鉴定时 的溶剂 酒精 95% (体积 分数) 除去杂 质以提 纯DNA DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精 二苯 胺 / 鉴定 剂 DNA遇二苯胺(沸水浴)会变蓝色 柠檬 酸钠 0.03 g/mL 抗凝剂 除去血液中的钙离子，防止血液凝固 【典例1】 下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是 ( )。 试剂 操作 作用 A 柠檬酸钠 与鸡血混合 溶解细胞 中DNA B 蒸馏水 与鸡血细胞混合 保持细 胞形状 C 蒸馏水 加入到溶解有DNA的 NaCl溶液中 析出DNA 丝状物 D 冷却的酒精 加入到过滤后含DNA 的NaCl溶液中 产生特定 的颜色反应 解析 在DNA的粗提取与鉴定实验中，柠檬酸钠可以防止血液凝固；鸡血中加入蒸馏水可以使细胞膜和核膜破裂；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在质量浓度为0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，可以获得较纯的DNA；DNA遇二苯胺(水浴加热)产生蓝色反应。 答案 C (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。 (2)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。 (3)所有的成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。 PCR技术操作注意事项 (4)PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。 (5)PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。 【典例2】 PCR实验中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 ( )。 A．反复洗涤 B．用酒精擦洗 C．高压灭菌 D．在－20 ℃储存 解析 为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用 ... ...
