2022-2023学年高二下学期生物人教版选修1-5.3血红蛋白的提取和分离课件（20张ppt）

(课件网) 课题3 血红蛋白的提取和分离 蛋白质的分离技术 （一）凝胶色谱法 1.概念： 凝胶色谱法,是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2.材料：凝胶 凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。 3.原理： 3.原理 相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶颗粒内部，路程较长，移动速度较慢； 相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，路程较短，移动速度较快。 重点 （二）缓冲溶液 1.作用： 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持PH稳定。 2.配制： 缓冲溶液通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。 3.配制PH值不同的缓冲液： 调节缓冲剂的使用比例 重点 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 （三）电泳 1.概念： 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 2.原理： 由于各种分子带电性质、大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3.常用方法： 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4.测定蛋白质分子量的常用方法： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS作用： SDS所带负电荷的量超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移速率仅取决于分子大小。 血液组成成分 血液由_____和_____两部分组成。 血细胞中_____细胞数量最多， 该细胞除水外含量最高的化合物是_____。 3.该化合物是由 _____和_____构成的，其中每条肽链中都含有一个能与O2和CO2结合的_____基团。 4.血红蛋白的作用是_____ 血浆 血细胞 红 血红蛋白 2条α-肽链 2条β-肽链 亚铁血红素 血红蛋白 运输O2和CO2 重点 血红蛋白的提取和分离 以哺乳动物红细胞为材料，初步分离血红蛋白。 1.样品处理 (1)红细胞的洗涤 ①目的： ②方法：a.采集血样(加入抗凝血剂柠檬酸钠)； b.低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆 c.在下层暗红色的红细胞液体中加入五倍体积的生理盐水稀释，缓慢搅拌，再离心，重复三次，洗涤干净的标志是上清液不再呈现黄色。 ●操作提示：洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白。 离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀。 去除杂蛋白 红细胞 血 浆 重点 (2)血红蛋白的释放 加蒸馏水(使红细胞吸水涨破)，再加40%体积的甲苯 (溶解细胞膜)，充分搅拌(使细胞破裂)，释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液 ①将搅拌好的混合液离心，试管中的溶液分为4层： ②将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，用分液漏斗分离出下层的血红蛋白溶液。 颜色 状态 所含物质 无色透明 液体 甲苯 白色 固体 脂溶性物质 红色透明 液体 血红蛋白 暗红色 沉淀 其他杂质 重点 1mL 2.粗分离———透析 (1)原理： (2)目的： (3)过程： 除去血红蛋白中相对分子质量较小的杂质。 透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。 重点 3.纯化———凝胶色谱法 目的： （1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②柱底部制作：橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。 ③柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。 ④将上述三部分按相应位置组装成一个整体。 除去样品中相对分子质量较大的杂质蛋白 （2）凝胶色谱柱的装填 ①计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量 ②凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液 ③装填：将凝胶悬液装入色谱柱内，装填尽量紧密，不得有气泡存在 ④洗涤平衡：用磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密 ●操作提示： 1.为了加 ... ...