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课件网) 专题二十七 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题 高考生物总复习知识讲解 基础篇 考点一 基因工程(重组DNA技术) 一、基因工程的基本工具 1.限制酶(限制性内切核酸酶) 来源 主要是原核细胞 作用 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一 条链中特定部位的 磷酸二酯键 断开 结果 形成黏性末端(如EcoR Ⅰ)或平末端(如Sma Ⅰ) 知识拓展 原核生物的限制酶不切割自身DNA的原因:原核生物中不存在该酶 的识别序列或识别序列已经被修饰。 2.DNA连接酶 来源 主要是大肠杆菌、T4噬菌体 作用 将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切 开的磷酸二酯键 主要 种类 E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶,前者只连接 黏性末端 ,后者既可连接黏性末端,又可连 接平末端(效率相对较低) 知识归纳 与DNA相关的酶的比较 酶种类 作用部位 底物 产物 作用过程 限制酶 磷酸二 酯键 DNA DNA片段 表达载 体的构建 DNA连接酶 DNA片段 DNA RNA聚合酶 核糖核苷酸 RNA RNA合成 逆转录酶 脱氧核苷酸 DNA 逆转录 DNA酶 DNA 脱氧核苷酸 DNA水解 DNA聚合酶 脱氧核苷酸 DNA DNA复制 解旋酶 氢键 双链DNA DNA的两条单链 DNA复制 3.载体 1)条件 注意:标记基因便于重组DNA分子的筛选。 2)种类: 质粒 (最常用)、噬菌体、动植物病毒等。 3)作用:携带外源DNA片段进入受体细胞。 4)特点:可在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上,随受体DNA同步 复制。 二、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 1)目的基因:主要指能编码蛋白质的基因,如Bt抗虫蛋白基因等。 2)筛选:从已知结构、功能清晰的基因中筛选是较为有效的方法之一。 3)获取目的基因 方法 获取目的基因 方法1 通过 化学合成 法直接人工合成,如利用DNA合成仪直接人工合成比较小的目的基因 方法2 可从基因文库(如基因组文库和cDNA文库)中获取 方法3 PCR 知识拓展 基因组文库和cDNA文库 项目 内容 仪器 PCR扩增仪(PCR仪) 原理 DNA半保留复制 前提 需要已知目的基因的一段核苷酸序列(以便根据这一序列合成引物) 条件 ①DNA母链(提供DNA复制的模板);②2种引物(使DNA聚合酶能够从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸);③耐高温的DNA聚合酶(催化合成DNA子链);④4种脱氧核苷酸(合成DNA子链的原料);⑤含Mg2+的缓冲液(Mg2+可激活DNA聚合酶);⑥高温条件(打开DNA双链) 一般 过程 结果 1个DNA→2n个DNA(n为扩增循环的次数) 鉴定 常用 琼脂糖凝胶电泳 鉴定PCR产物 4)PCR扩增目的基因 知识拓展 引物设计 (1)设计引物的原因:DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3' 端延伸DNA链。 (2)引物设计原则 ①设计两种引物,分别与DNA的两条链上的碱基互补配对:DNA是两条反 向平行的双链,用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 ②两种引物分别位于待扩增部位的两端(3'端),且延伸方向相反,以确保目 的片段全部被复制。 5' 3' 3' 5' 注意:可以在引物的5'端添加酶切位点等修饰,3'端不可以。 ③两种引物碱基序列不能互补。 如图,应选择引物B、C扩增目的基因。 疑难突破 思考 引物结合位置不在模板链端部时,第几次循环才能出现双链等长 的目标DNA片段 提示 第三次循环(如图)。 2.基因表达载体的构建(核心工作) 1)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可遗传给下一代。 2)基因表达载体的构成 3)构建过程 易混易错 启动子和起始密码子 启动子是DNA片段,启动转录过程,位于DNA上,与RNA聚合酶结合; 起始密码子是RNA片段,是翻译的起始位点,位于mRNA上。 3.将目的基因导入受体细胞 1)植物细胞(体细胞):农杆菌转化法、花粉管通道法。 2)动物细胞(受精卵):显微注射法。 3)原核细胞:常用Ca2+处理原 ... ...
