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课件网) 转基因动物的概念 借助基因工程技术把外源目的基因导入动物的生殖细胞、胚胎干细胞或早期胚胎，使之在受体染色体上稳定整合，并能把外源目的基因传给子代的个体，叫转基因动物（transgenic animals） 第一节 动物转基因技术 一、显微注射法制作转基因动物（以小鼠为例） 在显微镜下将体外构建的外源目的基因，用注射针注射到动物受精卵中，使之与动物基因组整合，从而得到转基因动物的方法(操作与植物受体相近) 构建目的基因的表达载体：目的基因应包含完整的ORF,顺式调控序列，加尾信号 线性DNA分子的准备 DNA浓度：1-3μg/mL 1.目的DNA的准备 超排受精卵的准备： 选择4-6周龄的小鼠，用孕马血清促性腺激素素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）先后进行腹腔注射，做超数排卵处理；注射后10-13小时超排卵，每个母鼠与一个公鼠交配。 假孕母鼠的准备： 通过注射PMSG和hCG诱导产生，再与结扎的公鼠交配 2.小鼠的准备和要求 处死经超排处理的小鼠，从输卵管膨大部位取出受精卵 解散卵丘细胞，清洗受精卵 在显微镜下确认和选择受精卵 3. 受精卵的分离 将受精卵置于培养皿或玻片的液滴内，用吸持针吸住受精卵；将外源基因注入受精卵的雄原核内 4.显微注射 将假孕小鼠麻醉，在腹部下方与最后一根肋骨平行的地方开一个小口，在输卵管壶口处用微吸管将注射过的受精卵移入，缝合伤口。按常规饲养，20天前后，后代幼鼠将产出 5.受精卵的移植 PCR Southern blot Northern blot Western blot 标记性状 6.转基因小鼠的鉴定 每天可注射几百个卵，但大约只有66%能存活；移入子宫后，大约25%的受精卵能发育成幼鼠；其中又有大约25%左右的幼鼠是转基因鼠 理想情况下，30-50/1000 一般情况下， 1/1000 显微注射法的效率 顺式调控序列 MAR序列 同源重组 转座子 提高目的DNA的整合率与表达率 外源基因整合效率低 随机整合或随机插入，存在插入突变的风险 方法复杂，技术性强，设备昂贵等 压力调节仪或程控注射仪 压力调节仪或程控注射仪 7.显微注射法的不足 首只转基因猴安迪和制备它的卵母细胞 逆转录病毒的结构 二、逆转录病毒法 受体 吞噬 脱外壳 逆转录 核蛋白复合体 有丝分裂 复合体进入核 为了保证逆转录病毒载体的感染功能，建立包装细胞，在包装细胞里表达三个逆转录病毒的结构基因。所以首先让携带有外源目的基因的逆转录病毒载体感染包装细胞，在包装细胞中被包装成新的子代病毒颗粒，再去感染动物宿主细胞 Mo-MLV (莫洛尼小鼠白血病病毒) 逆转录病毒载体的构建 逆转录病毒载体可同时感染大量胚胎，也可感染稍晚阶段的不同发育时期的胚胎；高效率感染并能在宿主细胞DNA上高度整合，可以大大提高基因的转移效率。但这一高的感染率绝对依赖于细胞的两个特性：一是细胞要具有逆转录病毒的受体，二是目标细胞需要进行细胞分裂。二者缺一不可 逆转录病毒介导转基因的优势 虽然逆转录病毒载体可同时感染大量胚胎，感染效率高，并能在宿主细胞DNA上高度整合，但只可以转移小片断的小于10kb的DNA。而且存在安全隐患。如逆转录病毒在靶细胞染色体上的整合可能造成： 1）破坏细胞正常生长的必须基因/抑癌基因 2）LTR激活原癌基因 3）染色体重排激活原癌基因 逆转录病毒的安全性问题 胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞）是指从哺乳动物囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的潜能性，能够分化出各种组织 用转基因技术将外源基因转移到ES细胞中，或通过同源重组等方法使外源基因整合到ES细胞的基因组中，再把ES细胞移入胚泡期的胚胎，然后移植代孕 三、胚胎干细胞法 1989年，Lavitrano等首次利用小鼠附睾精子与外源DNA温育产生转基因小鼠， ... ...
