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课件网) 第一节 体液调节是通过化学信号实现的调节 第一节 体液调节是通过化学信号实现的调节 第四章 基因工程 第二节 神经系统通过下丘脑控制内分泌系统 第二节 神经系统通过下丘脑控制内分泌系统 第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性 第3课时 基因工程的基本操作程序2 基因工程的基本操作步骤 获取目的基因 构建重组DNA分子 将重组DNA分子导入受体细胞 检测目的基因及其表达产物 目 录 将重组DNA 分子导入受体细胞 构建重组DNA分子（核心） 检测目的基因及其表达产物 （二）、构建重组DNA分子--核心 ①用一定的限制酶切割表达载体（质粒），使其出现一个切口，露出黏性末端。 ②用同一种限制酶切断目的基因DNA片段，使其产生同样的黏性末端。 ③将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。 利用表达载体构建重组DNA分子 --核心 1.如何构建重组DNA分子？ 那什么是表达载体呢？ 克隆载体：用于大量扩增外源DNA的载体。 目的：克隆基因可以获得大量的DNA分子，不仅用于基因诊断、法医鉴定、判断物种亲缘关系等研究工作，还可以用于指导合成大量稀有的蛋白质产物，如胰岛素、干扰素和抗癌药物等。 2.克隆载体与表达载体 为什么要构建克隆载体？ 许多外源DNA片段自身很难在受体细胞内成功复制，需要与含有复制起点的DNA分子相连 表达载体：使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体。表达载体包含适当的转录和翻译信号。 构建表达载体 的目的： 2）使目的基因能够表达和发挥作用。 1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以 遗传给下一代 复制原点：复制的起始点 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因 多个限制酶的识别序列：便于插入目的基因 3.基因表达载体的组成：复制原点+启动子+终止子+标记基因+多个限制酶的识别序列 思考：得到的一定是重组DNA分子吗？ 载体（质粒） 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割 带有黏性末端（或平末端）的切口 带有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 4、构建重组DNA分子 含有目的基因的DNA片段 思考：如何防止质粒或目的基因自身环化呢？ 基因两端用2种不同的限制酶切割，并用同样的2种酶切割质粒 用ＤＮＡ 连接酶连接时，可形成３ 种不同的连接物： 目的基因—载体连接物（正反向） 载体—载体连接物（自身环化） 目的基因—目的基因连接物（自身环化） 在构建重组DNA分子时,用同种限制酶剪切含有目的基因的DNA片段以及表达载体,然后用DNA连接酶将它们连接起来,形成重组DNA分子。在实际操作过程中可出现下图所示情况,据图回答问题。 “单酶切法”和“双酶切法” 1.黏性末端1与2能否经DNA连接酶连接 3与4呢 为什么 此现象说明“单酶切法”具有什么缺点 2.黏性末端1与4、2与3能否经DNA连接酶连接 此现象说明“单酶切法”具有什么缺点 提示 均能。因为同一种限制酶切割后形成的黏性末端互补(相同)。此现象说明“单酶切法”会导致质粒和目的基因的自身环化。 提示 均能。说明“单酶切法”会导致质粒与目的基因反向连接。 3.如何避免以上问题 提示 使用两种限制酶分别对目的基因和质粒进行切割(目的基因的两侧和质粒上含有这两种限制酶的酶切位点),且两种限制酶产生的黏性末端不同(不互补),这样能有效地避免质粒与目的基因的反向连接以及自 ... ...
