为探究猪SLA-2 抗原的呈递规律。研究者运用基因工程手段将SLA-2基因进行改造并在猪肾上皮细胞（sT2细胞）中表达。实验的主要流程如图1，图1中SLA-2基因长度为1100bp， 质粒B的总长度为4445bp， 其限制酶切点后的数字表示距复制原点的距离。图1中的限制酶的识别序列及切割位点如图2所示。请回答： 1. 过程①中，PCR扩增目的基因的反应体系为_____（写出3种即可）和引物等. 2. 下列4种引物中应选择的是_____。 A. 5'-GCTCTAGAATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC B. 5'-GTTGCGGCCGCTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC C. 5'-GCGATCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC D. 5'-GTTTGATCACTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC 3. 控制表达载体大量扩增的组成元件是_____，该结构发挥作用时通常需要的酶是_____。 4. 若用 Sau3AI和 XbaI 完全酶切质粒C后电泳，请在答题纸相应位置画出可能得到的电泳条带，同时标出DNA片段长度。（不考虑 PCR 时所用的引物长度对结果的影响）_____ 5. 科研中常用嘌呤霉素对真核细胞进行筛选，一般选择最低致死浓度的前一个浓度作为筛选浓度的原因是：既可以让大部分没有抗性的细胞死亡又不会让_____。用没有抗性的细胞实验，实验结果如下图3，根据实验结果最佳的嘌呤霉素筛选浓度为_____。 6. 过程⑥的受体细胞是_____，为了提高该细胞克隆培养的成功率，应把它放在37°C的_____中进行培养。 7. 过程⑦研究人员用_____（填物质）检测肾上皮细胞生产的抗原肽。 【答案】1. Taq DNA聚合酶、4种dNTP、缓冲液 2. AB 3. ①. 复制原点 ②. 解旋酶和DNA聚合酶 4. 5. ①. 具有抗性的细胞死亡 ②. 300ug/mL 6. ①. 猪肾上皮细胞 ②. CO2培养箱 7. 抗 SLA 抗原肽单克隆抗体 【解析】 【分析】基因工程主要包括四部：首先提取目的基因；然后将目的基因与运载体结合；接着将目的基因导入受体细胞；最后检测目的基因的表达。目的基因与运载体结合即基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤；PCR技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，因此这一技术的原理是DNA双链的复制。 【1题详解】 PCR是在体外进行DNA复制，原理是DNA半保留复制，反应体系中应该有Taq DNA聚合酶、缓冲液、引物、4 种dNTP等。 【2题详解】 目的基因应插入启动子与终止子之间，引物的5'端需连接限制酶识别序列，经分析表格中相关内切酶的切割位点，a含有XbaI别切割位点，b含有NotI的识别切割位点，San3AI的识别切割位点也存在于BclI的识别切割位点中，4种引物中应选择的是AB。 【3题详解】 载体上的复制原点与复制相关，能让表达载体大量扩增；该结构发挥作用时通常需要的酶是解旋酶（破坏氢键）、DNA聚合酶（聚合形成DNA），参与DNA的复制。 【4题详解】 由图可知，质粒C共有[4445+1100-（2310-2273）]=5508bp，用Sau3AI和XbaI完全酶切质粒B后，Sau3AI可识别并切割BclI的切割位点，具体分析见下图。 所以酶切后可能得到的电泳条带如图所示： 质粒C共有[4445+1100-（2310-2273）]=5508bp，用Sau3AⅠ和XbaⅠ完全酶切质粒C后，BclⅠ、Sau3AⅠ和XbaⅠ处均断开，质粒C加入了目的基因片段，且BclⅠ和Sau3AⅠ的相对位置没有发生变化，因此，酶切后固有的片段为140bp和3305bp，则另一片段为，5508-140-3305=2063。 C质粒三个片段分别是：3305，2063，140。酶切后可能得到的电泳条带如图所示： 【5题详解】 最低致死浓度既可以让大部分没有抗性的细胞死亡又不会让具有抗性的细胞死亡；根据实验结果分析，最佳的嘌霉素筛选浓度为300ug/mL，此时的细胞数量接近于0。 【6题详解】 过程⑥是让重组质粒转入肾上皮细胞，受体细胞是肾上皮细胞；为了提高该细胞克隆培养成功率，一般将其放在CO2恒温培养箱中培养。 【7题详解】 检测 ... ...
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