高中生物学人教版必修2：探究实践 DNA 片段的扩增及电泳鉴定-教学课件(共17张PPT)

(课件网) 探 究 · 实 践 D N A 片 段 的 扩增及电泳鉴定 -一、实验原理 二、材料用具 三、实验步骤 四、注意事项 五、结果分析 一、实验原理 ( 一 )PCR扩增DNA片段的原理： 1.PCR利用了热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解 旋和结合，PCR 仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 一 次PCR一般要经历30次循环。 2.PCR 扩增DNA片段还利用了半保留复制的原理。 5’ -3’ 高温 5’ -3’ 3’ -5’ 变性 3’ -5’ 低 温 -3’ -5’ -5’ 复 性 Ⅲ -3’ -5’ -3’ -5’ 5’ 5’ 3’ 延伸 中温 5’ 3’ 5’ 3’ 1 .分离：DNA 分子具有可解离基团，在一定的pH 下，这些 基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分 子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 2.鉴定：PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。DNA 分子在凝胶中的迁移速率与凝胶浓度、DNA 分子大小和构象等 有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外 光下被检测出来。 3.纯化：电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后 的克隆操作。 a b 一、实验原理 ( 二 )DNA 片段电泳鉴定的原理： 1.凝胶浓度：琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。 凝胶浓度越小，筛孔越大， DNA 分子迁移速率就越高；凝胶 浓度越大，筛孔越小， DNA 分子迁移速率就越低。 2.DNA分子的大小：当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子 因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大 的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。 电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样 孔近；而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远。相同大 小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。 3.DNA的构象：迁移速率：双螺旋环状DNA>双螺旋链状 DNA> 单 链DNA。 一、实验原理 (三)影响DNA迁移速率的因素： 大分子迁移 速率低 小分子迁移 速率高 一大小不同的 DNA 分子 凝胶孔隙 不同大小的DNA 分子在凝胶中电泳示意图 加样孔 电泳 二、材料与用具 ( 一 ) 用 具 ： 1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增) 2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所) 3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体) 4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头) 5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等) TagDNA 聚合酶一 引物一 4种脱氧核苷酸 — DNA 模板一 PCR扩增仪 1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增) 2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所) 3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体) 4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头) 5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等) 二、材料与用具 ( 一 ) 用 具 ： 1.PCR仪(自动控温，实现DNA的扩增) 2.微量离心管(实际上是进行PCR反应的场所) 3.微量移液器(用于向微量离心管转移PCR配方中的液体) 4.一次性吸液枪头(微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头) 5.电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等) 二、材料与用具 ( 一 ) 用 具 ： 10倍浓缩的扩增缓冲液(含Mg +) 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液(实为dNTP) 1μL 20μ mol/L的引物I 2.5μL 20μ mol/L的引物Ⅱ 2.5μL H O 2833μ L 1-5U/μ L的Taq DNA聚合酶(即耐高温的DNA聚合酶) 1—2U 模板DNA(用量为1pg-1μg) 5—10μL 总体积 50μL 二、材料用具 (二)试剂： 1.4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA 聚合酶、模板DNA、扩 增 缓冲液、无菌水。 PCR反应体系的配方 (二)试剂： 2.电泳缓冲液(TAE或TBE)、凝胶载样缓冲液(内含指示 剂一 —溴酚蓝)、琼脂糖和核酸染料(常用核酸染料为 EB即溴化乙锭)等。 EB可插入DNA双链碱基之间，形成EB-DNA 复合物。该复合物在紫外线激发下，发射 出红橙色 ... ...