3.2 课时2 基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定（(共34张PPT，含1个视频）

(课件网) 3.2 课时2 基因表达载体的构建、 将目的基因导入受体细胞、 目的基因的检测与鉴定 1.能阐述基因表达载体构建的流程。 2.能阐述将目的基因导入受体细胞的方式及原理。 3.能阐明目的基因的检测与鉴定所涉及的技术原理。 上节回顾：PCR技术 1.目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成 质粒 （1）启动子 基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA （2）终止子： 限制酶切割位点 基因的尾端，能终止mRNA的转录 （3）标记基因 作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 复制原点 （4）目的基因 二、基因表达载体的构建 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 如何构建抗虫棉的基因表达载体？ 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。 ② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③ 将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。 载体 基因表达载体 3.过程 思考：使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？ 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 请结合下图，思考： （1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？ 不能 因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。 质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。 （2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？ 如果能有何弊端？ 能 ①质粒、目的基因发生自身环化； ②质粒与目的基因会发生反向连接。 （3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时 处理质粒、外源DNA的优点是什么？ ①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接； ②还可以防止目的基因与载体的反向连接。 ①载体与表达载体区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。 表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 ②工具酶：限制酶、DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 三、将目的基因导入受体细胞 方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 ———显微注射法 ———Ca2+处理法 我国科学家独创 常用 （1）花粉管通道法（我国科学家独创） ②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 目的基因 目的基因 适用生物：开花植物 1.目的基因导入植物细胞 （2）农杆菌转化法 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 （可转移的DNA） 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 导入 插入 表达 农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析 第一次拼接 第二次拼接 第一次导入 第二次导入 两次拼接： 第一次拼接是将目的基因拼接到T ... ...