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课件网) 第1节 基因工程及其技术 第2课时 基于PCR技术，运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等内容，并能够归纳出PCR和DNA复制的异同点。 掌握琼脂糖凝胶电泳法的原理和操作步骤，并能够利用电泳法对PCR扩增产物进行鉴定和产物数量的计算。 01 02 5' 3' 3' 5' DNA解旋酶 DNA聚合酶 5' 3' RNA引物 游离的dNTP DNA连接酶 细胞内DNA复制： 一、聚合酶链式反应（PCR)技术 1.提出者： Kary Banks Mullis 1944.12-2019.8 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器 美国科学家穆里斯获1993年诺贝尔化学奖 2.含义： PCR技术是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术，整个过程是在体外进行，故又叫做体外DNA扩增技术。 DNA半保留复制、DNA热变性 3.原理： 4.条件： 模板（目的基因）、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲溶液（含Mg2+ ) 待扩增的DNA片段（模板） 引物 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（dNTP） 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 5' 3' DNA引物 3' 5' 5' 3' DNA引物 3' 5' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 变性（94℃） 退火 （55℃-65℃） 延伸（72℃） Taq聚合酶 游离的dNTP 5.过程： 小组讨论1： 思考PCR过程中利用的模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲溶液（含Mg2+ )分别有什么作用？ 耐高温的 DNA 聚合酶/Taq酶（作用：催化子链的合成） 4 种脱氧核糖核苷酸/dNTP（作用：合成DNA的原料） 模板 DNA（作用：合成子链的模板） 2种引物（作用：使DNA聚合酶从引物的3'端开始合成子链） Mg2+缓冲液（作用：激活 DNA 聚合酶/维持适宜的pH、离子浓度等） 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 目的基因 5’ 引物 6.PCR产物的计算问题: 在第3轮扩增时能得到完整的目的基因 经过n轮扩增后共有目的基因2n-2n个 经过n轮扩增，共消耗引物1 2n-1个 第n轮扩增，需要消耗引物1 2n-1个 6.PCR产物的计算问题: PCR技术 DNA复制 相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞内（主要在细胞核内） 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 小组讨论2: PCR技术与DNA复制过程比较？ 二、利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 （1）尝试运用PCR仪扩增DNA片段 （2）关注PCR技术的应用 （3）学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术 1.实验目的： 2.实验原理： 通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 PCR仪 3.实验试剂： 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 2.5mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 4μL 10μmol/L的引物Ⅰ 2μL 10μmol/L的引物Ⅱ 2μL H2O 35μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 1μL 4.实验过程： 移液———离心———扩增 移液 离心 扩增 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min 30次 94℃,30s 55℃, ... ...
