PCR扩增及电泳图 (2023·山东卷)科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_____。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白_____(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 解析：(1)基因表达载体中启动子是为了启动下游基因的表达，表达首先需要转录，因此与启动子结合的酶是RNA聚合酶。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗生素抗性基因)，以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含质粒和J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2与R1或F1与R2。转录时mRNA的合成方向为5′→3′，又知J基因转录的模板链位于b链，所以b链左侧为3′端，右侧为5′端；PCR扩增时引物F1与模板链3′端的碱基进行互补配对，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 答案：(1)RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等(2个即可) (2)F2与R1或F1与R2 a链 (3)J-V5融合蛋白 不是 ·任务一 PCR扩增技术的分析 (1)当选择引物F2和R2时，能否通过有无扩增产物判断J基因连接到质粒中且插入方向正确？说明理由。 提示：不能。F2和R2分别与质粒DNA的序列互补配对，未插入J基因，也可得到扩增产物，不能确定J基因是否连接到质粒中。 (2)选择引物F1和R1，得到扩增产物，能否说明J基因连接到质粒中且插入方向正确？说明理由。 提示：不能。F1和R1均与J基因配对，得到扩增产物，只能说明细胞中有J基因，无法判断插入方向是否正确。 (3)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，应选择什么引物？ 提示：F1与R2或F2与R1。 (4)PCR反应时，引物延伸的方向是什么？ 提示：引物延伸的方向是从引物的5′→3′。 (5)基因转录时，转录的方向如何判定？ 提示：从启动子位置开始，沿着模板链的3′→5′。 (6)判断a链启动子一侧到终止子一侧的方向。 提示：5′→3′。 (7)与F1配对的是基因的哪条链？ 提示：b链。 ·任务二 电泳条带分析 (1)J-V5融合蛋白能与哪种抗体发生特异性结合？ 提示：抗J蛋白抗体，抗V5抗体。 (2)重组质粒上的J基因表达的J蛋白是否含有V5？说明理由。 提示：含有。与质粒连接的是J基因与V5基因的融合基因。 (3)用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是什么蛋白？ 提示：J-V5融合蛋白。 (4)抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，能否说明条带2不是重组质粒上的J基因表达？说明理由。 提示：能。重组质粒上 ... ...
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