考题分布 考查类型 命题分析 2020·山东·T25 基因启动子的定点编辑 通过近几年考题分析可知，PCR或基因编辑是每年的必考知识点，多数以对某种疾病的基因治疗、科研成果等为情境，考查利用PCR扩增DNA片段中引物的设计、限制酶的选择等内容 2021·山东·T25 PCR技术 2022·山东·T25 PCR技术 2023·山东·T25 PCR检测 2024·山东·T5 PCR技术 2024·山东·T25 PCR技术和基因编辑 1．PCR引物的设计 (1)引物长度要适宜：引物的长度一般为15～23 bp，常用的长度为18～21 bp。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，过短则特异性差。 (2)引物GC含量要适宜 ①引物3′端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高， 而其他三种碱基的错误引发效率相对小一些。 ②3′端防止连续三个C或G，引物的GC含量一般为45～55%，过高或过低都不利于引发反应。 ③上下游引物的GC含量不能相差太大。 (3)引物自身及引物之间不应存在互补序列：碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。 (4)引物5′端可以修饰，3′端不可修饰 ①引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 ②引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。 ③在引物的5′端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。 2．常见特殊的PCR (1)反向PCR技术 ①原理：用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。 ②过程：如图所示 实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切核酸酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序列进行分析研究。 (2)PCR定点突变 ①重叠延伸PCR：如下图所示，该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 ②大引物PCR：大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 3．CRISPR-Cas9基因编辑 (1)Cas9蛋白特点：实质是一种限制酶，会用RNA来引导自己找到目标DNA。Cas9-RNA复合物会在DNA上不停“弹跳”，直到找到正确的位点。Cas9会附着到DNA上，检测邻近的序列是否和充当向导的RNA匹配。这种RNA叫作向导RNA(简称gRNA)，而只有当gRNA和DNA匹配时，Cas9蛋白才会对DNA进行切割。 (2)基因编辑的程序 1．某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是( ) A．利用PCR 技术扩增基因时不需要解旋酶来打开 DNA 双链 B．不能在同一反应体系中进行dsred2 基因和amy基因的扩增 C．dsred2基因和amy 基因混合后只能得到一种类型的杂交链 D．杂交链延伸得到 dsred2-amy融 ... ...
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