热点三 新型基因编辑工具PASTE，实现定点插入超大片段基因 【命题热点】 CRISPR-Cas9基因编辑系统，是由Cas9酶（负责切割DNA双链）和gRNA（负责识别和靶向目标基因组特定位点）组成，gRNA引导Cas9到达基因组的特定位点并指导Cas9切割DNA双链。当Cas9和靶向致病基因的gRNA被递送到细胞中时，会切割致病基因的特定位点，造成DNA双链断裂（DSB），细胞随后启动DNA修复过程，但这种修复过程会出现错误，从而实现对致病基因的敲除。 如果在Cas9切断DNA双链时，同时递送一段DNA模板，细胞在修复过程中就可能将这段DNA模板整合进基因组。但这一过程依赖于DNA双链断裂，这可能会导致有害的染色体缺失、重排、碎裂等等。而且这一过程通常只在分裂细胞中起作用，因为不分裂细胞没有活跃的DNA修复过程。 该研究调的希望能开发出一种新工具，能够在不不引起DNA双链断裂的情况下，去除并替换有缺陷的基因。为了实现这一目标，他们将目光放在了整合酶上，这是一类来自病毒（噬菌体）的酶家族，噬菌体利用整合酶将自己的基因组插入到宿主细菌基因组中。 PASTE———粘贴 在这项研究中，研究团队专注于丝氨酸整合酶，它可以插入大片段DNA序列，最长可达5万个碱基对。这些整合酶的目标是被称为附着位点的特定基因组序列，它起着“着陆垫”的作用。当整合酶在宿主基因组中找到正确的附着位点时，就会与之结合，然后将携带的DNA片段整合进去。然而，将这些整合酶应用于人类基因治疗很有挑战性，因为它们在基因组上的附着位点很特定，很难对整合酶进行重编程以定位到其他位点。 Omar Abudayyeh、Jonathan Gootenberg 团队意识到，CRISPR-Cas9能够靶向特定位点，将其与整合酶结合，有望实现可编程的大片段基因插入。 基于上述想法，研究团队开发了一种名为PASTE（Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements）的新工具。该新工具包含Cas9切口酶（只切断DNA一条链，而不造成DNA双链断裂），它在gRNA的引导下切割特定基因组位点，此时Cas9切口酶融合的逆转录酶将整合酶所需的附着位点序列整合进切割位点。通过这种方式，就可以将整合酶所需的附着位点插入基因组中的任何位置，而且这种插入不引起DNA双链断裂，此时，整合酶就可以与附着位点结合，将大片段DNA序列插入。 注：Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements（基于位点特异性靶向元件的可编程添加），简称PASTE，PASTE这个词本身有粘贴、插入的意思 Jonathan Gootenberg 表示，这项研究是实现可编程的DNA大片段插入梦想的一大步，通过这一技术可以很容易地根据需要定制附着位点和整合DNA片段。 从上述技术原理来看，PASTE很容易让人想到刘如谦团队开发的先导编辑（Prime Editor），在先导编辑的Cas9切口酶和逆转录酶的基础上融合了丝氨酸整合酶，相当于使用先导编辑先在基因组中插入丝氨酸整合酶的附着位点，然后通过丝氨酸整合酶来插入大片段DNA。 刘如谦团队于2021年12月在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing 的研究论文。 刘如谦团队开发了升级版的先导编辑（Prime Editor），将其命名为———双先导编辑（Twin Prime Editing，TwinPE）。TwinPE同样不会导致DNA双链断裂，通过一个先导编辑蛋白（prime editor protein）和两个向导RNA（pegRNA），可实现对人类基因组的可编程的大片段DNA的删除、替换、整合和倒位。 实现大片段DNA的定点插入 在这项研究中，研究团队使用PASTE技术将DNA片段插入了包括肝细胞、T细胞和淋巴母细胞等人类细胞中，研究团队测试了13个不同的DNA片段，其中包括一些具有治疗意义的基因，能够将它们插入到基 ... ...
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