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课件网) 基因工程 基因工程的基本操作程序 【学习目标】 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。 2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案 【重难点】 1.将目的基因导入受体细胞的具体操作方法。 2.目的基因的检测与鉴定的方法 目 录 基因表达载体的构建 01 03 目的基因的检测与鉴定 将目的基因导入受体细胞 02 01 基因表达载体的构建 （核心步骤） 基因表达载体的构建（核心步骤） 1.构建基因表达载体的目的： （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 2.基因表达载体的组成 思考：各原件的作用是什么？ 基因表达载体的构建（核心步骤） 注意：启动子≠密码子 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 复制原点： DNA复制的起始位点 标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 目的基因插入到启动子和终止子之间 基因表达载体的构建（核心步骤） 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 翻译的起始信号(编码氨基酸) 使转录在所需要的地方停下来 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 目的基因上游 mRNA尾端 mRNA首端 目的基因下游 DNA DNA mRNA mRNA 基因表达载体的构建（核心步骤） 3.基因表达载体的构建过程： ① 用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口 ② 用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段 ③ 将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子 基因表达载体 基因表达载体的构建（核心步骤） 质粒 抗生素 抗性基因 Sma Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ 图1 EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ 目的基因 BamH Ⅰ Hind Ⅲ 外源 DNA 图2 （1）构建基因表达载体时，能否用Sma Ⅰ限制酶切割质粒？为什么？ 不能；因为Sma Ⅰ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因（抗生素抗性基因是质粒上的标记基因，若被破坏，无法进一步筛选重组DNA分子） 基因表达载体的构建（核心步骤） 质粒 抗生素 抗性基因 Sma Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ 图1 EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ 目的基因 BamH Ⅰ Hind Ⅲ 外源 DNA 图2 （2）若只用EcoR Ⅰ限制酶切质粒和外源 DNA，则构建基因表达载体时会出现哪些结果？ 质粒自身环化 正向连接 反向连接 目的基因多拷贝与质粒连接 基因表达载体的构建（核心步骤） 质粒 抗生素 抗性基因 Sma Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ 图1 EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ 目的基因 BamH Ⅰ Hind Ⅲ 外源 DNA 图2 （3）为避免出现上述情况可以选择什么限制酶对质粒和外源 DNA 进行切割？ 使用 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA 双酶切法 优点：①避免质粒自身环化 ②有利于载体与目的基因正向连接，避免反向连接 基因表达载体的构建（核心步骤） 4. 限制酶的选择原则 （1）不破坏目的基因：切点应位于目的基因两端，如图甲中可选择Pst Ⅰ，而不选择Sma Ⅰ 至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选。 （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ 基因表达载体的构建（核心步骤） （3）确保出现相同黏性末端原则： 切割目的基因与质粒所选的限制酶应产生相同的黏性末端 ①可以选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中Pst Ⅰ ②为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保 ... ...
