(
课件网) 基因工程 基因工程的基本操作程序 【学习目标】 1.简述目的基因的筛选和获取方法 2.简述PCR的原理、条件及过程 【重难点】 利用PCR获取和扩增目的基因 目 录 目的基因的筛选与获取 01 DNA片段的扩增及电泳鉴定 02 转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右） 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。 你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？ 从社会中来 01 目的基因的筛选与获取 苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。 这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用到的 目的基因———Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因 第一步：目的基因的筛选与获取 目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因 主要指编码蛋白质的基因 目的基因的种类：根据需求的不同，目的基因也不同，如生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因 那么，如何筛选与获取目的基因呢？ 第一步：目的基因的筛选与获取（筛选合适的目的基因） 随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBanK）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能 从相关的已知结构和功能清晰地基因中进行筛选是较为有效的方法 第一步：目的基因的筛选与获取 1.通过化学方法直接人工合成目的基因 获取目的基因的方法 DNA合成仪 要求：①基因比较小 ②核苷酸序列已知的基因 2.通过构建基因文库获取目的基因 基因文库种类：①基因组文库（包含一种生物的所有基因） ②部分基因文库（只包含一种生物的部分基因，如cDNA文库） 第一步：目的基因的筛选与获取 拓展：基因文库的构建过程 某生物体全部DNA 许多DNA片段 受体菌群体 限制酶 与载体连接、导入 受体菌群体 cDNA 某生物体发育的某个时期的mRNA 逆转录 与载体连接、导入 基因组文库 cDNA文库 第一步：目的基因的筛选与获取 3.利用PCR获取和扩增目的基因（常用） 苏云金杆菌 Bt基因 ？ 快速获得大量Bt基因 提取 前提：已知目的基因或其上下游的核苷酸序列 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 （长度通常为20-30个核苷酸） ⑴ 全称：聚合酶链式反应 ⑵ 原理：DNA的半保留复制（在体外大量复制目的基因的核苷酸序列） ⑶ 原料：DNA模版、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 第一步：目的基因的筛选与获取 复习回顾：DNA复制 碱基互补配对原则（A与T、C与G配对保证复制的准确进行） (2)条件: 4种游离的脱氧核苷酸 DNA的两条链 DNA解旋酶、DNA聚合酶等 ATP (3)复制原则: 能量： 模板： 原料： 酶： 半保留复制、边解旋边复制 (1)特点: 合成子链 解旋 形成新DNA 解旋酶 DNA聚合酶 第一步：目的基因的筛选与获取 DNA复制和PCR反应的条件对比 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸（dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常为小的单链DNA至少需要2种引物） 反应还需要其它条件，如控温系统、缓冲液（一般添加Mg2+）--能够调节pH，激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 第一步：目的基因的筛选与获取 （5） PCR扩增的过程 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 变性 双螺旋解开 PCR仪 ①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链 第一步 ... ...
