第1节重组DNA技术 的基本工具 从社会中来 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒DNA双螺旋的直径只有2 nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。 转基因木瓜 环斑病毒的 非转基因木瓜 限制性内切核酸酶、DNA连接酶，载体。 限制性内切核酸酶： DNA连接酶： 载体： 这些 “分子工具”各具有什么特征呢？ 那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？ 准确切割DNA分子，得到所需要的目的基因。 能将目的基因连接到载体上。 能将目的基因导入受体细胞中。 一、限制性内切核酸酶--“分子手术刀” 1、来源： 主要从原核生物中分离纯化出来 2、种类： 迄今分离的限制酶有数千种 3、作用特点： 具有专一性。具体表现如下 4、作用部位: 特定切点上的磷酸二酯键 5' 3' 5' 3' T A G G T A T C C A 磷酸二酯键 ①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。 ②使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 5、两种常用的限制酶： 限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例: E：Escherichia (属) co：coli (种) R：RY13 (品系) I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序 EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶； SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。 EcoRⅠ和SmaⅠ 黏性末端 黏性末端 （1）EcoRI限制酶的切割: 当限制酶在它识别序列得中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。 只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 中轴线 中轴线 （2）SmaI限制酶的作用 只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 当限制酶在它识别序列中轴线处切开时，产生的是平末端。 在C和G之间切开 6、结果： 产生黏性末端或平末端 7、限制酶的识别序列的特点 (1)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如：EcoRⅠ、SmaⅠ (2)少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成 (3)限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列 1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 破坏外源DNA，保护自我 2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 缺乏特定的核苷酸序列 思考·讨论 3．请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 同种限制酶产生的黏性末端相同， 不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。 4．请结合下图，推断限制酶切一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？ 断开两个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团； 产生2个黏性末端；消耗两分子水。 EcoRⅠ 黏性末端 ……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…… ……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…… ……CTACGATG ……GATGCTACTTAA AATTCCCTAA…… GGGATT…… AATTCCGTAG GGCATCTTAA 黏性 末端 目的基因 练习：使用EcoRI剪切目的基因 G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 用同种限制酶切割(EcoRⅠ) 把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？ 缺口怎么办？ G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 二、DNA连接酶--“分子缝合针” 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。即将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的 。 DNA连接酶主要有两类 ： 、 。 2. E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 磷酸二酯键 1.DNA连接酶的作用 A G T C A T T C G A T A 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来； （1）E.coli DNA连接酶 两DNA片段要 ... ...
