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课件网) “荧光大肠杆菌”的诞生日记 生物 高三年级上学期 单元主题：基因工程 “荧光大肠杆菌”的诞生日记 主线任务：GFP基因表达载体的构建 “荧光大肠杆菌” 的诞生日记 GFP基因表达载体的构建 1.作用： 将外源基因“送入” 受体细胞, 并对目的基因进行大量复制。 2.种类： 质粒 噬菌体、 动植物病毒等 (最常用)、 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有 能力的 。 自我复制 环状双链DNA分子 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 工具一：基因导入受体细胞的载体———分子运输车” GFP基因表达载体的构建 工具一：基因导入受体细胞的载体———分子运输车” 启动子： 复制原点： 终止子： 标记基因： 基因的上游 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 EcoR Ⅰ Hind Ⅲ 基因的下游 终止转录 便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 DNA复制的起始位点。 多克隆位点 Xho Ⅰ BamH Ⅰ Bgl Ⅰ 位置： 功能： 位置： 功能： GFP基因表达载体的构建 3. 作用特点： 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列, 并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 1. 来源： 主要从原核生物中分离纯化出来的 2. 种类： 数千种 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） 简称限制酶 识别的专一性 切割的专一性 一般为6个核苷酸；少数为4个、8个或其他数量。 工具二：限制性内切核酸酶———分子手术刀” 赫伯特·韦恩·伯耶 1968年，美国科学家伯耶和研究小组成员在一位年轻生物化学家古德曼（HowardGoodman）的帮助下，从大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一种限制酶，根据命名原则称为EcoRⅠ。 资料卡 限制酶EcoRⅠ的由来 GFP基因表达载体的构建 工具二：限制性内切核酸酶———分子手术刀” EcoRⅠ 的识别序列 C G A A 3 5 T G 5 C T T 3 A A T 简图： 识别序列的特点: 两条单链从5 —3 的碱基排列顺序是一样的，即回文序列。 切割位点 切割位点 G CTTAA 5 3 3 5 AATTC G 粘性末端 粘性末端 粘性末端 粘性末端 GFP基因表达载体的构建 BamH Ⅰ Hind Ⅲ Bgl Ⅰ SmaⅠ GGATCC CCTAGG 5 3 3 5 AAGCTT TTCGAA 5 3 3 5 AGATCT TCTAGA 5 3 3 5 CCCGGG GGGCCC 5 3 3 5 思考：1、不同限制酶的切割位点有什么特点？切出的末端类型分别是什么？ ②在中轴线上 ①在中轴线两侧 2、不同的限制酶切出的粘性末端一定是不同的吗？ ：粘性末端 ：平末端 有可能相同，如BamH Ⅰ和Bgl Ⅰ，二者互为同尾酶 3、不同的限制酶切出的粘性末端可以通过碱基互补配对相连接吗？ 同尾酶可以。只要是粘性末端相同，就可以碱基互补配对相连接！ 工具二：限制性内切核酸酶———分子手术刀” 复制原点 卡那霉素抗性基因 终止子 启动子 选择启动子和终止子之间多克隆位点上（MCS）的限制酶，且在载体的其他位点无该酶的识别序列。 GFP基因表达载体的构建 工具二：限制性内切核酸酶———分子手术刀” pET-28a(+) 载体 ATG…....GATCCATATGTTACGTTATA …......TAA TAC…….CTAGGTATACAATGCAATAT….......ATT 3 5 GFP基因 5 3 引物1 引物2 EcoRⅠ EcoRⅠ GFP基因表达载体的构建 工具二：限制性内切核酸酶———分子手术刀” GPSSS GFP基因 EcoRⅠ酶切 ATG…....GATCCATATGTTACGTTATA …......TAA TAC…….CTAGGTATACAATGCAATAT….......ATT 3 5 GFP基因 5 3 GAATTC GAATTC CCTAAG CCTAAG GFP基因表达载体的构建 工具二：限制性内切核酸酶———分子手术刀” GFP基因 重组DNA分子 GFP基因表达载体的构建 工具三：DNA连接酶———分子缝合针” 将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 1、作用： 2、 ... ...
