第14讲 基因工程及其应用 考点1 基因工程的基本工具与基本操作程序 1.基因工程标记基因的分类和应用 分类:标记基因可分为选择基因和报告基因,二者都可以用来筛选标记目的基因是否成功转化。 (1)选择基因。 ①直接选择:载体上的选择基因一般是一些抗生素抗性基因,在受体细胞的培养体系中加入该抗生素,就可以只保留转入载体的受体细胞,原理如图所示: ②间接选择:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。 ③常用方法———影印法”筛选含有重组质粒的细胞。 ⅰ.将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图1、2、3、4、5菌落。 ⅱ.再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落,如图1、5菌落。 (2)报告基因。 ①报告基因则是指其编码产物能够被快速测定且不依赖于外界压力的一类基因。常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)等。 ②常用方法———蓝白斑”筛选含重组质粒的细胞。 大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和蓝色物质,在经人工插入外源基因后,大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断,无法形成完整的β-半乳糖苷酶,故不能对无色化合物X-gal进行切割,菌落呈白色。 2.限制酶切割位点选择的四点要求 (1)位置要求:限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因结构内部(若载体有多个标记基因,并非都不能破坏,要至少保留一个),所选酶切位点应位于启动子和终止子之间。 (2)对象要求。 ①单酶切:为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接,通常使用同一种限制酶将两者切割,用DNA连接酶连接后,会出现外源DNA片段与载体正向连接(A),外源DNA片段与载体反向连接(B),多个外源DNA片段串联后与一个载体互连(C),多个载体与多个外源DNA片段混连(D),载体自身环化(E),外源DNA自身环化(F)等。 ②双酶切:双酶切可以确保目的基因的正确插入,要求两个酶切位点位于目的基因的两侧,如图所示可选择PstⅠ和BamHⅠ,但也要注意酶切位点个数和相对位置,如不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。 限制酶选择的两点特殊情况 ①不同的限制酶所产生的末端相同,两端也可连接,如MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同,可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因,用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。 ②虽然双酶切可以避免载体和目的基因的自身环化,但也避免不了目的基因双片段或多片段环化。 (3)数量要求:如果所选限制酶的切割位点不止一个,如图选择SmaⅠ进行酶切,则切割重组后可能会丢失复制原点,那么载体进入受体细胞后不能自主复制,所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。 (4)特殊要求:例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶,设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ,则甲、乙、丁质粒均不宜选取,丙质粒宜选取。 3.基因工程的基本操作程序 (1)目的基因的筛选与获取。 (2)基因表达载体的构建———重组质粒的构建。 ①启动子和终止子:启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上);终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA)上。 ②目的基因插入位置:启动子与终止子之间。 ③利用乳腺生物反应器生产药物时,应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。 (3)将目的基因导入受体细胞。 农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 ①两次拼接:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位;第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。 ②两次导入:第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌;第二次导入是 ... ...
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