第2课时 多聚酶链式反应扩增 DNA片段 1.通过与细胞内DNA分子的复制相比较,了解PCR技术的基本操作、反应条件。 2.能根据DNA分子的结构特征、增殖方式,说明PCR的原理。 3.通过对PCR实验的操作及结果分析,培养严谨的科学态度和实事求是的科研精神。 一、PCR的概念 PCR全名是①反应,它是一种②迅速扩增DNA片断的技术,其特点是以极少量的③为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。? 二、PCR扩增的条件及原理 1.PCR扩增的方向:通常将DNA的羟基(—OH)末端称为④,而磷酸基团末端称为⑤。DNA的合成方向总是从子链的⑥延伸。? 2.PCR原理(即利用DNA复制原理):双链DNA⑨。? 3.PCR反应的条件:PCR反应需要在⑩中才能进行,需提供:DNA模板,,四种脱氧核苷酸,,同时要控制温度。? 4.PCR扩增的过程:反应的每一轮循环都包括、和延伸三步。? (1)变性:温度以上,双链DNA在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。? (2)复性:温度下降到50 ℃左右,两种引物通过与两条单链DNA结合。? (3)延伸:温度上升到左右,在聚合酶的作用下,以四种脱氧核苷酸为原料,根据碱基互补配对原则,从引物的5'→3'端延伸合成与模板互补的DNA新链。? 三、实验操作步骤 1.准备。 2.移液:用按照配方在微量离心管中依次加入各组分。? 3.混合:盖严离心管的盖子,用手指轻轻弹击壁管。 4.离心:将微量离心管放在离心机上,离心约10 s,目的是。? 5.反应:将离心管放入PCR仪中,设置程序进行反应。 1.DNA复制为什么必须有引物? 2.PCR的反应过程包括哪三个阶段? 3. PCR操作中模板DNA是否需要解旋?需要解旋酶吗? 知识点一: PCR原理 1.体外DNA复制需要哪些条件?什么是3'端,什么是5'端?如何理解DNA复制的方向? 2.DNA的热变性原理是什么? 3.比较细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增,完成表中内容。 项目 细胞内DNA复制 PCR扩增 不 同 点 能量 ① ATP提供能量? ② ATP提供能量? 酶 ③ 酶、④ 聚合酶? 耐热的⑤ DNA聚合酶? 是否 有转录 伴有转录、产生引物 无转录、需加入⑥ ? 温度 体内温度 ⑦ ? 相 同 点 1. 原料为⑧ ;? 2.复制原理为严格遵循⑨ 原则;? 3.模板为DNA; 4.都需要与模板相结合的⑩ ? 知识点二:PCR的反应过程及实验设计 1.PCR一般经历三十多次循环,每次循环可以分为三个基本步骤———变性、复性和延伸。 (1)PCR 循环第一步加热变性的具体变化是什么?这种变化有何意义? (2)PCR 循环第二步引物与靶序列退火的温度为多少?具体的变化是什么? (3)PCR 循环第三步延伸模板是什么?需要什么酶?遵循什么原则? 2.PCR技术具有哪些特点? 3.如何测定DNA的含量? 例1 (1)PCR利用了DNA的 原理,在 的高温下,作为模板的 解聚为 ,这个过程称为 。? (2)PCR反应需要的条件: 、 、 、 、 。? (3)在PCR反应中与解旋酶作用相同的操作是 。? 例2 下列关于PCR实验操作过程的叙述错误的是( )。 A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 ℃储存 C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化 D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换 1.标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三个步骤,这三个步骤需要的温度依次是( )。 A.94 ℃、55 ℃、72 ℃ B.72 ℃、55 ℃、94 ℃ C.55 ℃、94 ℃、72 ℃ D.80 ℃、55 ℃、72 ℃ 2.下列有关PCR技术的叙述正确的是( )。 A.作为模板的DNA序列必须不断地加入每一次的扩增当中 B.作为引物的脱氧核苷酸序列必须不断 ... ...
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