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课件网) 专题五 DNA和蛋白质技术 课题2: 多聚酶链式反应扩增DNA片段 地震和海啸 DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就有可能为案件的侦破提供证据。 1.你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？ 2.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？ 用PCR技术扩增DNA 遗传病的诊断、古生物学、基因克隆、DNA序列测定 想一想 学习目标 1．体验PCR常规的分子生物学实验方法。 2．理解PCR的原理。 3．讨论PCR的应用。 ★分子生物学研究中最强大的实验技术之一 ★其本质是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程 美国科学家 穆里斯(K.B.Mullis) 发明了PCR技术 1993年诺贝尔奖 多聚酶链式反应（PCR） 定义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 意义：有效解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。 应用：广泛应用于医学、个体识别、亲子鉴定、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。 一、DNA分子的知识回顾 C、H、O、N、P 1、组成元素 脱氧核苷酸 2、基本单位 3、脱氧核苷酸结构 T C G A A DNA分子的-OH端为3/ ; 磷酸基团的末端为5/ 。 4、脱氧核苷酸的连接 5、DNA分子的平面结构 5'端 3'端 识别 ： -OH端为3′端; 磷酸基团的末端为5′端。 6、细胞内DNA复制的基本条件 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 引物结合在模板链的3′端 DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链 注意 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（ RNA） 打开DNA双链 模板 合成子链的原料 催化子链合成 使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 思考：体外扩增DNA时，如何提供与体内DNA复制相似条件？ 变性（ 80～100℃ ） Taq DNA聚合酶 （耐高温） 一小段DNA，长度为20～30个核苷酸 Taq DNA聚合酶是美国微生物学家布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，从水生耐热细菌Taq中提取的耐高温的DNA聚合酶，称为Taq DNA聚合酶。 DNA复制前提 一定的缓冲液 体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、两种引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。 二、PCR（多聚酶链式反应） （一）PCR原理 DNA双链 变性（加热80-100℃ ） 复性（缓慢冷却） DNA单链 变性的目的： 解开双链 复性的目的： 有利于引物1和引物2与两条单链的结合 PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。 DNA双链的复制 (二)PCR反应的过程 1、变性： 温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚成为单链。 2、复性（退火）： 温度下降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、延伸： 温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。 5? 引物1 5? 引物2 5? 5? 模板DNA 25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。 变性95oC 5? 引物1 5? 引物2 5? 5? 模板DNA 含有母链的DNA分子占： 不含有引物1（或2）的DNA分子占： 2／2n 1／2n 复制n次： 含有母链的DNA分子占： 不含有引物1（或2）的DNA分子占： 2／2n 1／2n 复制n次： PCR的反应过程总结 每个循环包括：变性 ———复性——— ... ...
