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课件网) 多聚酶链式反应扩增DNA片断 --PCR技术polymerase chain reaction 一、基础知识 （一）、PCR技术的概念 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百份的DNA拷贝 （二）、PCR技术的应用 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定 1细胞内DNA复制条件分析： 条件 组分 作用 模板 DNA的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 酶 解旋酶 DNA聚合酶 打开DNA双螺旋 催化合成DNA子链 能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能 引物 RNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端 延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。 2、DNA合成的方向 （1）DNA单链两端的命名 ①基本单位－脱氧核苷酸 1号碳 5号碳 3号碳 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成3,5-磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成3,5-磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端 3’端 3’端 5’端 5’端 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成3,5-磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端 DNA的反向平行结构： 1通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链： 2、DNA分子两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。 3’端 3’端 5’端 5’端 DNA的反向平行结构： 1通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链： 2、DNA分子两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。 引物：一小段单链DNA或RNA，一般20～30个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。 后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来 DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合。 ［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？ DNA双螺旋结构提供模板； 碱基互补配对； DNA聚合酶的复查功能。 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链。 DNA合成的方向从子链由5’ 端向 3’端延伸 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链。 DNA合成的方向从子链由5’ 端向 3’端延伸 3、DNA复制的前提 ———是_____ 用_____方法 思考：DAN复制的前提是什么？ 体外扩增DNA 如何打开双链？ 双链的解开 控制温度 DNA双链 单链 变性（加热80-100℃） 复性（缓慢冷却） 4、DNA 分子的热变性原理： 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合 PCR的反应过程-- DNA 分子的热变性原理 变性：在95℃时DNA解旋 复性：在55℃时引物与DNA单链结合 延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列） 思考：高温使DNA解旋，但普通DNA聚合酶会失活, _____找到耐高温DNA聚合酶 P21托马斯.布鲁克 5、体外DNA复制的条件(PCR 反应的条件) ①DNA模板； ②分别与两条模板链相结合的两种引物； ③四种脱氧核苷酸； ④耐高温的聚合酶； ⑤ 控制温度 ... ...
