-是一种体外扩增特定基因或DNA序列的技术 PCR技术-聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction） PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 实验原理 {21E4AEA4-8DFA-4A89-87EB-49C32662AFE0} 体内DNA复制 体外DNA复制 模板 亲代DNA 原料 4种脱氧核苷酸（dNTP） 酶 解旋酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 引物 RNA √ √ X √ X DNA 卡里·穆利斯（Kary Mullis） 1944年生于美国。 1983年发明了PCR技术 1976，錢嘉韻从Thermus Aquaticus成功分离出嗜热DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶,最适温度为72℃，在95℃仍具有酶活性。 {21E4AEA4-8DFA-4A89-87EB-49C32662AFE0} 体外DNA复制 模板 亲代DNA 原料 4种脱氧核苷酸（dNTP） 酶 Taq DNA聚合酶 引物 DNA 核糖体DNA部分片段示意图 酵母细胞中编码核糖体18S rRNA、5.8S rRNA、25S rRNA的3个DNA序列，中间相隔2个内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer），简称ITS。成熟的核糖体RNA中不包括ITS序列。 广泛存在于真菌中，多样性程度较高 常用于鉴定病原真菌，选择酿酒酵母菌株，通过测序和比对PCR产物序列推测亲缘关系 电泳 电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。 琼脂糖是从红色海藻中提取的多糖聚合物，加热熔化后再冷却能凝结形成凝胶。 核酸是带有负电的生物大分子，在电场作用下会向正电极迁移。在电场强度一定时，核酸分子越大迁移速率越慢。 凝胶电泳是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。 DNA标准溶液（marker）是一组已知长度和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中用做确定DNA片段长度的参照物。 Trans2K Marker Trans5K Marker 染色 亚甲基蓝（又名“亚甲蓝”）可以将无色的DNA染成蓝色。 75%的乙醇和蒸馏水对凝胶进行脱色。 实验目的 简述PCR技术的原理，说出PCR扩增过程。尝试用PCR仪扩增酵母菌rDNA部分片段的实验操作。 尝试用琼脂糖凝胶电泳技术对PCR扩增产物进行检测的基本操作。 关注PCR技术的应用，认同现代生物技术的价值。 材料用具 材料 酵母细胞悬液：称取0.1 g食用高活性干酵母（酿酒酵母），放于盛有100 mL无菌蒸馏水的三角瓶中。在温暖的环境下活化2小时。 PCR相关试剂 双蒸水(ddH2O) 10×扩增缓冲液(PCR buffer) 10 mmol/L dNTP 10μmol/L引物A溶液 10μmol/L引物B溶液 Taq DNA 聚合酶 电泳相关试剂 Tris-硼酸（TBE）电泳缓冲液 市售6×上样缓冲液（loading buffer）：内含甘油可以增加样品密度，确保DNA能够沉入上样孔内；还含有少许溴酚蓝作为电泳指示剂，电泳时溴酚蓝的迁移速率与小片段DNA相近。 市售DNA标准溶液（Marker） 染色相关试剂 0.1% 亚甲基蓝溶液：称取0.1 g 亚甲基蓝溶于100 mL 蒸馏水中。避免接触皮肤和眼睛,避光保存。 75% 乙醇 藏于4℃冰箱的蒸馏水 (或使用0.002% 亚甲基蓝溶液：将2 mL 的0.1% 亚甲基蓝溶液加入10 mL电泳缓冲液中,再加88 mL蒸馏水，避光保存。) 实验用具 PCR仪、琼脂糖凝胶电泳设备（含梳子、胶盒、水平电泳槽和电泳仪电源）、微量移液器及枪头、微量离心管、培养皿、三角瓶、封口膜、橡皮筋、冰盒、记号笔、三脚架、微波炉（枪头、微量离心管使用前需进行高压蒸汽灭菌） PCR反应 凝胶电泳 制备琼脂糖凝胶 加样 跑电泳 染色 观察 实验步骤 实验流程图 1. PCR反应 PCR反应体系 PCR反应条件流程图 预变性 95 ℃ 10 min ↓ 变性 95 ℃ 1 min ↓ 退火 55 ℃ 1 min ↓ 延伸 72 ℃ 1 min ↓ 延伸 72 ℃ 10 min 循环33次 梳子 模具 熔化的琼脂糖 琼脂糖 凝胶 加样孔 2.凝胶电泳 制备琼脂糖凝胶 用微量移液器向50μL PCR产物中加入10μL 6×上样缓冲液（Loading buffer），并反复吹吸混合均匀。将10 μL样品混合液缓慢加到加样孔内。 加样 电泳仪电源 电泳槽 琼脂糖凝胶 正极 负极 样品 DNA迁移方向 电压80 V，电泳 ... ...
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