第四章 反向遗传学及其相关技术 一、概述 （一）遗传研究的二条途径 1、表→里：正向遗传学研究 杂交或诱变→表型观察→遗传规律→确定存在的基因及数目→基因的功能及作用性质。 这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传学采用的研究方法。 2、里→表：反向遗传学研究 在已知DNA序列的基础上，通过DNA重组、定点突变、插入/缺失等遗传修饰手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。 与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传学技术。 （二）RNA病毒的反向遗传学 采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。 能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆，一般是在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝，使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。 RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列，检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以在体内(in vivo)有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。 RNA病毒的反向遗传操作 RT-PCR构建RNA病毒的全长cDNA，并进行遗传修饰 ↓ 与RNA聚合酶启动子结合 体外转录病毒RNA ↓ 转录物RNA感染哺乳动物细胞 ↓ 拯救到活病毒 ↓ 拯救病毒的表型变化 ↓ 病毒基因组的表达、调控、致病机理、 病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等 单正股RNA病毒： RNA聚合酶 + mRNA – + + – + 中间型 结构蛋白 + 子代正股RNA 单负股RNA病毒： RNA聚合酶 – + 结构蛋白 – 子代负股RNA 逆转录病毒： ＋＋ RNA RNA/DNA 中间体 逆转录酶 DNA/DNA 宿主 ＋＋ 子代RNA 正股RNA与负股RNA病毒、逆转录病毒? （三）真核生物的反向遗传学 采用反向遗传学鉴定基因功能是真核生物功能基因组学的主要内容。 研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。 利用基因敲除或基因沉默而产生的功能变化研究基因功能是主要的反向遗传学技术。 二、反向遗传学相关技术 1、基因的同源重组 2、基因的位点突变 3、基因沉默 基因敲除 利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。 通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。 1、基因的同源重组 完全敲除：通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除。 条件敲除：将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段。 完全敲除→条件敲除→特定组织/时间基因敲除 基因敲除 1）通过同源重组的基因敲除步骤 构建重组载体 ↓ 重组DNA转入受体细胞核内 ↓ 筛选目的细胞 ↓ 转基因生物 重组载体的类型： a)替换性载体系统： 包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。 b)插入性载体系统： 插入基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段。 用替换型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验 2）Res同源重组系统 ———源于λ噬菌体Res重组酶的重组系统 Ha 和Hb: 同源重组区域 Pa 和Pb: 引物位点 sm: 筛选标记 Red 同源重组技术用于基因打靶 3）Cre-LoxP同源重组系统 ——— 源自P1噬菌体的重组系统 属于传统的同源重组载体，但具有时空调控的功能。该系统由P1噬菌体的Cre重组酶和LoxP位点两部分组成。 Cre重组酶：由Cre基因编码，识别LoxP位点，介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 LoxP位点：由2个13bp的反向重复序列和1个8bp的间隔区域构成。 Cre酶 Cre酶 Cre酶 Cre重组酶 13bp的反向重复序列 Cre-LoxP 重组 ... ...
~~ 您好，已阅读到文档的结尾了 ~~
