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课件网) 第4单元 遗传的分子基础 第5课时 DNA片段的扩增(PCR)及电泳鉴定 内容索引 核心体系 学习目标 活动方案 检测反馈 学 习 目 标 学习目标 1. 概述DNA片段扩增(PCR)技术的原理及其过程。2. 概述PCR及电泳鉴定的操作方法。 核 心 体 系 活 动 方 案 PCR 技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图所示)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。请回答下列问题。 活动一 概述PCR技术的原理及其过程 (1) 生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是_____。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_____。这两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的_____。 (2) 当温度降低时，引物与模板_____端结合，在_____ _____的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是_____，遵循的原则是_____。 (3) PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP 、酶以外，至少还需要三个条件，即：含_____(离子)液体环境、适宜的_____和_____，前者由PCR仪自动调控，后者则靠_____来维持。 解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键 3′ 耐高温的DNA聚 合酶(Taq酶) 四种脱氧核苷酸 碱基互补配对 Mg2＋ 温度 酸碱度 缓冲液 (4) 为什么PCR过程需要添加引物？PCR引物的化学本质是什么？其与细胞内DNA复制所需引物有何区别？ 【答案】 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。PCR所需引物的化学本质是一段长度为20～30个核苷酸组成的DNA片段。细胞内复制所用引物是RNA短链，在体外扩增(PCR)需要的引物是DNA单链片段。 (5) PCR的首要任务就是引物设计，引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。PCR引物设计的依据是什么？设计引物时应注意哪些方面？ 【答案】 PCR设计引物的依据是目的基因两端的部分核苷酸序列。PCR扩增DNA片段进行引物设计时，需要设计两种分别与两条模板链碱基互补的引物，两引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对，引物的长度既不能过长也不能过短。 (6) PCR技术中两条子链都是连续合成的，体内DNA是半不连续复制的，其原因是什么？ 【答案】 在细胞内DNA复制时，双链只有部分打开，其中一条子链是连续合成，而另一条子链是不连续合成的。 (7) PCR技术需要的条件适宜，但又不同于细胞内DNA复制的条件，请从酶、原料、ATP等角度比较两者的区别。 【答案】 细胞内DNA复制需要解旋酶和DNA聚合酶，原料为4种游离的脱氧核苷酸，需添加ATP；PCR技术不需要添加ATP,4种dNTP既可作为原料又可提供能量,不需解旋酶,需要耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)。 (8) 目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是什么？ 【答案】 PCR反应体系需要在较高温度条件下进行，因此PCR反应中需使用热稳定性高的Taq酶，而大肠杆菌的DNA聚合酶在高温下会失活。 在实验室中进行PCR的实验操作步骤主要包括准备、移液、混合、离心、反应五个步骤。PCR实验操作中，通常要用到微量离心管，具体操作时用微量移液器按PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可，一次PCR一般要经历30多次循环。请回答下列问题。 活动二 概述PCR的实验操作方法 项目 变性 复性 延伸 预变性 94 ℃，5 min — — 30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min 最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min (1) 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏 ... ...
