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课件网) PCR的应用 基因工程拓展 2025/3/26 连接两个DNA片段 1.重叠延伸PCR A．第一阶段过程中的产物是依赖引物1、引物2和引物3、引物4扩增的结果 B．引物2和引物3上均含有与模板链不能互补的碱基 C．PCR过程中需要先加热至90 ℃以上后再冷却至72 ℃左右 D．第三阶段需要利用引物1和引物4获得目的基因 1.下图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。分析不正确的是( ) 练习 C 定点突变 1.重叠延伸PCR 1.逆转录PCR mRNA 、RNA病毒 RNA酶消化 2.热启动PCR 55℃ 0℃ 减少反应起始时引物错配形成的产物 3.降落PCR 从模板上扩增 扩增先前的PCR产物 第一阶段：扩增18-20个循环 第二阶段：扩增20-25个循环 提高特异性扩增 4.巢式PCR 模板 使用外引物，进行第一次PCR 使用内引物，进行第二次PCR 第一次PCR产物 第二次PCR产物 提高特异性扩增 切胶回收 纯化目的产物 5.定量PCR 实时定量检测PCR扩增产物 染料法 TaqMan探针法 游离的染料几乎不产生荧光， 和双链DNA结合后发射强荧光。 探针完整时，不产生荧光；探针被Taq酶水解，R与Q分离，发出荧光。 5.定量PCR 实时定量检测PCR扩增产物 循环数 荧光强度 Ct值 Ct值：荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数 阈值 1. 样本中初始模板数量越多，Ct值越 。 2.若A样本Ct值为20，B样本Ct值为30，则A样本和B样本中模板DNA的比值为 。 检测样本CT如果值小于或等于30，且指数增长期明显，则检测结果呈阳性，表明患有新型冠状病毒。 练习 6.反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列 限制酶切 自身环化 反向PCR 测序 已知序列 未知序列
