3.2基因工程的基本操作程序 课件（共30张PPT) 2024-2025学年人教版（2019）高中生物学选择性必修3

(课件网) 3.2 基因工程的基本操作程序 DNA合成仪 显微注射技术 1.酶切 同种限制酶 防止倒连、自连→两端选择两种限制酶 防止切断目的基因等→载体和目的基因选同尾酶 注意：限制酶特性 二、构建基因表达载体 （1）限制酶的识别序列 限制酶所识别序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列 在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列： DNA连接酶 2.连接 ①PCR法（注意引物的设计） ②双抗生素抗性基因鉴定 ③测序法 3.鉴定 质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆。 否则形成蓝色克隆。 典型例题 三、将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌转化法 ①特点： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 插入 植物细胞染色DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 ②转化过程: 具有趋化性（酚） 注意：大多基因表达载体在受体细胞内是独立存在的！ 两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 将目的基因导入到植物细胞中方法-- 农杆菌转化法 （2）花粉管通道法 用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 2.将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 提纯含目的基因表达载体 受精卵 显微注射 移植到输卵管或子宫 受精卵发育 新性状动物 （2）操作: 显微注射技术 3.将目的基因导入微生物细胞 （1）微生物作受体细胞原因： （2）常用法： Ca2+处理 常用菌： 大肠杆菌 （3）过程： Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。 （感受态细胞法） 实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。 四、目的基因的检测与鉴定 检测— 鉴定——— ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 ———检查是否成功 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插 入了目的基因 常用PCR技术检测DNA水平和RNA水平 用抗原抗体杂交技术检测蛋白质水平 DNA分子杂交 基因探针 待测DNA 单链DNA或RNA片段，带有某种标记，能与目标DNA或RNA的一条链发生碱基互补配对。 抗原—抗体杂交 分子杂交 （2）方法:RNA分子杂交 （3）方法:抗原—抗体杂交 鉴定——— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。 （4）个体生物学水平鉴定 基因编辑 1.CRISPR/Cas9 ①设计合适的向导序列 ②将向导序列和Cas9基因构建基因表达载体 ③转化 ④表达并组装Cas9/gRNA复合体 ⑤定点切割（敲除绝大部分外显子/敲除个别外显子，移码突变） ⑥鉴定（PCR：扩增出的条带小或者无条带/分子杂交/测序） ② Cre-lox 介导的基因组 ... ...