(
课件网) 多聚酶链式反应 扩增DNA片段 ——— PCR实验 分子生物学研究中最强大的实验技术之一 美国科学家 穆利斯(K.B.Mullis) 发明了PCR技术 1993年诺贝尔奖 多聚酶链式反应（PCR） 定义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 意义：有效解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。 应用：广泛应用于医学、个体识别、亲子鉴定、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。 （一）PCR原理 在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似。 一、基础知识 DNA双链复制 PCR定义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 1.1、DNA分子的组成成分和结构 DNA 分子的基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。 脱氧核甘酸 4 磷酸 碱基 脱氧核糖 1、DNA的复制 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 碱基 1 2 3 4 5 O ATGC DNA的基本单位－脱氧核苷酸 5 4 3 2 1 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5 3 3 5 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 多脱氧核苷酸链结构简图 1.2、DNA分子的平面结构 A T G C A G C T 氢键 5'端 3'端 识别 ： DNA分子的3′ 端与5′ 端 -OH端为3′ ; 磷酸基团的末端为5′。 5'端 3'端 1.3 细胞内DNA的复制过程 DNA反向平行的双螺旋结构 DNA的复制方向 DNA聚合酶不能从头开始开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3’端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸。 DNA母链 引物 DNA的复制方向 DNA的复制过程 1.DNA解旋：解旋酶在局部展开双螺旋结构的DNA分子为单链， 2.引物合成：引物酶辨认起始位点，以解开的一段DNA为模板，按照5'到3'方向合成RNA短链。形成RNA引物。 3.DNA片段的生成：在引物提供了3'-OH末端的基础上，DNA聚合酶催化DNA的两条链同时进行复制过程。 4.RNA引物的水解：当DNA合成一定长度后，DNA聚合酶水解RNA引物，在引物部位换上DNA片段(冈崎片段)。 5.DNA的连接：DNA连接酶将DNA片段(冈崎片段)的磷酸二酯键连接起来，形成完整的DNA分子。 引物：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。 1.4 细胞内DNA复制条件 参与的组分 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 在DNA复制中的作用 打开DNA的双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 酶：解旋酶、DNA聚合酶 模板：DNA两条链 原料：4种脱氧核苷酸 引物：一小段RNA 思考：体内DNA复制的条件是什么？ 体外扩增DNA 如何提供相似环境？ 体内DNA复制 PCR反应 能量：ATP 模板： 原料： 引物： 能量： 酶： 目的DNA 4种脱氧核苷酸 Taq聚合酶（耐高温） 一小段RNA（或一小段单链DNA DNA双链 单链 变性（加热80-100℃ ） 复性（缓慢冷却） PCR仪 PCR技术的原理总结 利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。 体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液、严格控制温度的温控设备。 复制的方向：子链的5’端向 3’端延伸。 (二)PCR的反应过程(三十多次循环) 变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，称为变性。 复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性。 延伸：温度上升到7 ... ...
