课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 教学准备 1.?? 教学目标 1、了解PCR技术的基本操作 2、理解PCR的原理 3、讨论PCR的应用 2.?? 教学重点/难点 教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作 教学难点：PCR的原理 3.?? 教学用具 教学课件 4.?? 标签 教学过程 （一）引入新课 回忆DNA分子的结构 1、组成元素：C、H、O、N、P 2、基本单位: 脱氧核苷酸 3、脱氧核苷酸结构 （二）、细胞内的DNA复制 1、概念：由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程 2、时期：有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期 3、场所：细胞核（主）、线粒体、叶绿体 4、模板：DNA母链 5、原材料：脱氧核苷酸 6、基本条件:酶、ATP、原料、模板 7、复制过程: ① DNA的解旋???? ② RNA引物的合成 ③ DNA的生成???? ④切掉引物生成冈崎片断??? ⑤ DNA片断的连接 8、复制特点: 边解旋边复制(过程）、半保留复制（结果） 9、遵循原则：碱基互补配对原则 10、精确复制的原因： ①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 ②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行 （三）、聚合酶链式反应 PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。 1．PCR原理 PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似： 1．1细胞内DNA复制条件分析： 1．2细胞内DNA复制过程 （1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6） 核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图） 由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。 DNA双螺旋结构的反向平行结构： （2）DNA的复制过程: 解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。 引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。 DNA聚合酶结合： 子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。 后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链） 子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。 感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。 ［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？ DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。 ［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。 1．3? DNA分子复制的人工控制 解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。 恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。 反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。 ［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质） 2．PCR的反应过程 变性：在95℃时DNA解旋 复性：在50℃时引物与DNA单链结合 延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列） 3．实验操作 3．1 PCR反应体系： 缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水 3．2 实验操作步骤 3．3 按照PCR反应体系配方配制反应液； （1）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中； （2）将微量离心管放到PCR仪中； （3）设置PCR仪的工作参数。 （4）DNA在PCR仪中大量扩增。 3．4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。 4．实验注意事项 （1 ... ...
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