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课件网) 第一节 植物的转基因技术 一、植物转基因技术的基本路线 1.分离目的基因 2.将目的基因与载体连接，形成重组DNA 3.利用细菌繁殖扩增重组DNA 4.将与表达载体相连的重组DNA导入到目标植物的细胞中 5.筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株 6.大规模种植 二、 转基因的受体系统 1.植物组织受体系统 受伤的组织，愈伤组织等 2.植物细胞原生质体系统 3.生殖细胞受体系统 单倍体培养作为受体；直接在生殖细胞受精时进行基因转化 4.叶绿体转化系统 优点：①便于外源基因定位整合，②基因多拷贝，表达量高，③导入的外源基因性状稳定、安全性好，④能直接表达原核基因 三 、外源基因导入植物的方法 1. DNA直接转移法 1）化学刺激法 PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙等化学试剂等处理原生质体，可使其捕获外源DNA 2）电击法 在适当的外加电压下，细胞膜可能被击穿，使得外源DNA容易进入细胞内。原生质体不受伤害，而且膜孔可恢复 3）显微注射法 借助显微注射仪，将外源DNA通过机械方法直接注射到受体细胞 5）脂质体介导法 是将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。转化效率较高，简单易操作，重复性好 4）基因枪法 也称微粒轰击法 将DNA包被到金粒或钨粒上然后把这些粒子加速推进靶细胞。优点是转化受体迅速简单、取材广泛，不受基因型限制，金属微粒的喷射面广，植株可育性高，转化频率高等 6）微激光束法 利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞 7）花粉通道法 将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子或早期胚体细胞。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高 1）Ti 质粒介导的整合转化程序 Ti 质粒的结构与功能 豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌--农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti (Tumor) 2. 载体介导法 Ti 质粒的结构图谱 整个质粒 200 - 250 kb 其中 T-DNA 12 - 24 kb tms 的编码产物负责： 合成吲哚乙酸 tmr 的编码产物负责： 合成植物分裂素 tmt 的编码产物负责： 合成氨基酸衍生物冠瘿碱 2）植物病毒介导的转染 例如：以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物 第二节 转基因植物的筛选与检测 报告基因 (reporter gene) 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体 一、报告基因检测 1.抗生素抗性基因 npt、 aphIV、 spt、 cat、 ble npt, 新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、G418，巴龙霉素及新霉素等具有抗性； aphIV, 潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素具有抗性； spt, 链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具有抗性； cat, 氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧失抗菌素活性。 aacc3和aacc4, 庆大霉素3-N-乙酰转移酶基因，对庆大霉素有抗性； ble，博来霉素抗性基因，对博来霉素有抗性 注： 2.抗除草剂抗性基因 Bar，编码磷化麦黄酮乙酰转移酶（PAT），使PPT（磷化麦黄铜）的自由氨基乙酰化而对PPT解毒。抗除草剂草丁膦和双丙氨磷； epsps，草甘膦抗性标记基因，抗草甘膦； als，绿黄隆抗性标记基因 3.显色或发光报告基因 ... ...
