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课件网) 第1节 基因工程及其技术 第4课时 利用大肠杆菌生产人类胰岛素，我们已经获取了胰岛素基因，接下来该如何使其在大肠杆菌中稳定存在呢？ 第二步：基因表达载体的构建 二、基因表达载体的构建———核心 1、目 的： 确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代， 使目的基因能够有效表达。 思考1：若要干扰素基因在大肠杆菌中稳定存在，并能够表达和发挥作用，载体还需要哪些结构？(阅读课本97页内容) a、复制原点 b、目的基因 c、启动子 d、终止子 位于基因的上游,是RNA聚合酶结合位点，驱动基因转录出mRNA 位于基因的下游,终止转录 e、标记基因 DNA复制起点 思考2：各个元件有什么作用？(阅读课本97页内容) 能控制表达所需要的特殊性状 初步筛选接受了目的基因受体细胞 ①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。 ②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。 2、过 程： 补充1：单酶切体系总结： ①质粒、目的基因会发生自身环化连接 ②质粒与目的基因会发生反向连接 缺点： 补充2：双酶切体系总结： 思考：双酶切有什么优点？ （1）不破坏目的基因：切点应位于目的基因两端，如图甲中可选择PstⅠ，而 不选择SmaⅠ。 （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不 要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 补充3：限制酶的选择原则 1.结合基因表达载体模式图分析以下问题： (1)图中a、b、c分别代表什么结构？ a为启动子、b为终止子、c为复制原点。 (2)启动子和终止子与起始密码子和终止密码子是一回事吗？ 不是，启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分。而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。 (3)为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？ 启动子位于目的基因的首端使转录开始，终止子位于目的基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。 主要是农杆菌转化法 ①农杆菌特点： 三、将目的基因导入受体细胞 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力 ②原理：农杆菌含有Ti质粒，其上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 1. 将目的基因导入植物细胞的方法 ③转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 插入 植物细胞染色DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 小组讨论： 农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的目的： (1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 (2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 2. 将目的基因导入动物细胞 ①常用方法： 显微注射技术 ②常用受体细胞： 受精卵 ③基本操作程序： 将含有目的基因 的表达载体提纯 受精卵 显微 注射 早期胚 胎培养 胚胎移植 发育成为具有 新性状的动物 注意：对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，受精卵具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点。 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。 3.将目的基因导入微生物细胞 ①原核生物的特点： ②常用方法： Ca2+处理法（感受态细胞法） 首先用 Ca2+ 处理大肠杆菌细胞 → 感受态细胞 → 将重组表达载体 DNA分子与感受态细胞混合 → 感受态细胞吸收 DNA 分子。 ③基本操作程序： Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性 1.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ① 首先取出转基因生物的 ... ...
