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课件网) 专题五 NDA和蛋白质技术 课题三 血红蛋白的提取和分离 1.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法； 2.说明凝胶色谱法的原理和方法； 3.说出电泳的基本原理和方法； 4.运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。 导入新课 蛋白质是生命活动不可缺少的 物质。随着人类基因组计划的 进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。 血红蛋白 含量 组成元素 分子质量 基本单位 氨基酸连接方式 细胞中含量最多的有机物 C、H、O、N等 高分子化合物，分子量很大 氨基酸 结构通式： 种类：20种 脱水缩合 一个氨基酸的氨基（—NH2）和另一个氨基酸的羧基（—COOH）相结合，同时脱去一分子H2O 钛键 分子结构 蛋白质结构的多样性 ①氨基酸的种类不同；②数目成百上千； ③排列顺序变化多端；④多肽链的空间结构千差万别 蛋白质功能的多样性 运输、调节、免疫、催化等，生命活动的承担着 （一）蛋白质提取与分离的依据－－ 蛋白质的物理化学性质差异 1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力 根据相对分子质量的大小分离蛋白质 根据分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同分离蛋白质 1.凝胶色谱法 （1）材料：凝胶 微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。 方法 原理 凝胶色谱法 电泳法 （2）原理： 小蛋白质 大蛋白质 混合物 上柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收集 大分子 收集 小分子 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子质量较小 相对分子质量较大 凝胶内部的通道 容易进入 无法进入凝胶内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较长 移动速度较慢 路程较短 移动速度较快 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 2.缓冲溶液 (1)概念： 在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。 (2)作用： 能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。 (3)配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。 (4)本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4 /Na2HPO4 ),目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。 3.电泳法 （1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 （2）原理： 分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 （3）类型： 由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同 在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.洗涤红细胞 血液 100mL 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色 （一）样品处理 2.释放血红蛋白 洗涤好的红细胞导入烧杯 加蒸馏水到原血样体积 加40 ﹪体积苯 充分搅拌10分钟 3.分离血红蛋白 红细胞 混合液 滤纸 过滤 脂类物质 有机溶剂 血红蛋白 烧杯 (4)透 析： ①过程： 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 ②目的： 除去样品中分子量较小的杂质。 （二）凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作 2.凝胶色谱柱的装填 3. ... ...
