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课件网) 多聚酶链式反应(PCR技术)， 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 1、DNA分子的组成成分和结构 DNA 分子的基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。 脱氧核甘酸 4 磷酸 碱基 脱氧核糖 那么DNA分子的平面结构怎样呢？ 二 、基础知识 A G C T 1、DNA的基本单位－脱氧核苷酸 多脱氧核苷酸链结构简图 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端 4、多脱氧核苷酸链得形成 2、DNA分子的平面结构 5'端 3'端 识别 ： DNA分子的3′ 端与5′ 端 -OH端为3′ ; 磷酸基团的末端为5′。 2、DNA分子复制的过程 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的 3′ 端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（ RNA） 打开DNA双链 模板 合成子链原料 催化子链合成 使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸 思考：体内DNA复制的条件是什么？ 体外扩增DNA 如何提供相似环境？ 变性（ 80-100℃ ） Taq聚合酶（耐高温） 20—30个核苷酸构成DNA或RNA DNA双链 单链 变性（加热80-100℃ ） 复性（缓慢冷却） 4、DNA 分子的热变性原理： 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合 一、PCR的原理（ PCR的技术原理） 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1~3步30轮 3、DNA复制的方向 DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸 2、步骤：变性 ———复性———延伸 PCR技术的原理总结 利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。 体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液、严格控制温度的温控设备。 复制的方向：子链的5’端向 3’端延伸。 二、PCR的反应过程 变性95oC 5? 引物1 5? 引物2 5? 5? 模板DNA 25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。 每个循环包括：变性 ———复性———延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 PCR的反应过程总结 三、 PCR反应的实验操作 1、PCR仪 设备及用具 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自动调控温度的仪器 三、 PCR反应的实验操作 （1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备） （2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） （3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） （4）将微量离心管放在离心机上（离心） （5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应） 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94°C,10min － － 30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 四、结果分析与评价 DNA 含量的测定：稀释→对照调零→ 测定→计算（公式见P ... ...
