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课件网) 5.3血红蛋白的提取与分离 null 不是所有牛奶都叫特仑苏 如何从混合物中提取、分离高纯度的蛋白质呢？ null 湖南郴州又现“大头娃娃” 一、基础知识 1、蛋白质提取与分离的依据 分子的形状和大小；电荷性质和多少；溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力。 性质 方法 ●分子大小 透析、凝胶色谱、密度梯度离心 ●电荷 电泳、离子交换色谱 ●溶解度 盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀 ●吸附性质 吸附色谱 ●对其他分子亲和力 亲和色谱 null 一、基础知识 琼脂糖凝胶 也称做分配色谱法 null 一、基础知识 2、凝胶色谱法 分离物质 相对分子质量较大 相对分子质量较小 通道 路程 速度 洗脱次序 较短 较长 较快 较慢 先从凝胶柱洗脱出来 后从凝胶柱洗脱出来 凝胶外部 凝胶内部 null 一、基础知识 2、凝胶色谱法 注意：凝胶颗粒在色谱柱中装填得十分紧密（图中有意画的稀疏）。 null 一、基础知识 3、缓冲溶液—洗脱液 问题1：什么是缓冲溶液？ 在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。 问题2：缓冲溶液的作用是什么？ 能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。 null 一、基础知识 3、缓冲溶液—洗脱液 问题3：缓冲溶液如何配置？ 通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。 问题4：本实验选用的缓冲溶液是什么？ 磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4) null 一、基础知识 4、电泳 null 一、基础知识 4、电泳 原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 凝胶电泳原理示意图 阴极 阳极 加样孔 缓冲溶液 琼脂胶 null 一、基础知识 4、电泳 电泳类型：琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（可以加SDS） null 一、基础知识 4、电泳 null 二、实验操作 1.样品处理： ①洗涤红细胞 ②释放血红蛋白 ③分离血红蛋白 2.粗分离： 透析 3.凝胶色谱纯化： 按分子量大小分离其他蛋白 4.纯度测定： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度 null 二、实验操作 血红蛋白 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁血红素基团 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子O2或一分子CO2，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 null 二、实验操作 血红蛋白（90%） null 二、实验操作 低速 null 二、实验操作 洗涤红细胞 加蒸馏水至原血液体积 加入40%甲苯 磁力搅拌器充分搅拌 思考： 1.蒸馏水的作用是： 2.加入甲苯的作用是： 3.充分搅拌的目的是： 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 null 二、实验操作 分离过程 红细胞 混合液 高速离心 10min 离心管 滤纸 过滤 脂类物质 烧杯 null 二、实验操作 有机溶剂 无色透明的甲苯层(第1层) 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层(第2层) 血红蛋白溶液 红色透明液体(第3层) 红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物(第4层) null 二、实验操作 目的：去除样品中分子量较小的杂质。 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL 1mL null 样品的处理及粗分离 1.红细胞的洗涤 3.分离血红蛋白溶液 2.血红蛋白的释放 采集血液 （血红蛋白的）纯化 （血红蛋白的）纯度鉴定 方法： 方法： 凝胶色谱法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 生理盐水 蒸馏水、甲苯 柠檬酸钠 4.透析 缓冲液 null （二）凝胶色谱操作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网， 再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻 ... ...
