微专题9 PCR中的引物和计算 一、(1)2 引物与DNA模板链通过碱基互补配对结合,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,从而延伸DNA子链 (2)引物 (3) Ⅱ 、 Ⅲ [解析] 由于DNA子链从5'端向3'端延伸,引物需要互补结合在模板链的3'端,即—OH端,则据图分析,选择的引物是 Ⅱ 、 Ⅲ 。 ● 典型例题 1.A [解析] 引物结合在模板链的3'端,通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3,A正确;引物结合在模板链的3'端,检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物2 和引物4进行PCR,B错误;若设计的引物与模板不完全配对,可适当降低 PCR 复性的温度,以便引物与模板链结合,C错误;DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的3'端连接脱氧核苷酸,D错误。 2.(1)四种脱氧核苷酸(dNTP)、耐高温的DNA聚合酶、(含Mg2+的)缓冲液 (2)引物特异性较低或混入了其他模板DNA 1和引物4 2和引物3 [解析] (1)PCR反应体系中应包含模板、引物、四种脱氧核苷酸(dNTP)、耐高温的DNA聚合酶、(含Mg2+的)缓冲液。(2)根据题意可知,利用题图所示4种可与Va基因结合的引物扩增,结果无论是哪对引物均扩增出了除Va基因外的其他DNA片段,原因可能是引物特异性较低或混入了其他模板DNA,导致扩增出了非目的DNA片段。在利用现有引物的前提下,为尽可能减少非目的DNA片段的产生,可以先使用引物1和引物4扩增,若扩增出的DNA片段是目的DNA片段,则再次以初次扩增产物为模板,并加入引物2和引物3进行第二次扩增,将成功扩增出目的DNA片段;若初次扩增的DNA片段是非目的DNA片段,则加入引物2和引物3进行第二次扩增时将可能扩增不出目的DNA片段。 二、激活耐高温的DNA聚合酶(或激活TaqDNA聚合酶) ①引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 局部发生碱基互补配对而失效 ②引物 Ⅰ '自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 [解析] 在PCR的过程中,需要在缓冲液中添加 Mg2+, Mg2+能激活耐高温的DNA聚合酶。①分析题图中引物可知,第1组引物中引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 的部分碱基之间存在互补配对关系,这可能会导致引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 发生局部碱基互补配对而失效;②第2组引物中引物 Ⅰ '自身存在互补配对关系,折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。 ● 典型例题 3.能与DNA母链碱基互补配对;两种引物之间不能构成碱基互补配对;引物的5'端应具有限制酶酶切位点 5'端 [解析] 引物设计的要求:①能与DNA母链碱基互补配对;②两种引物之间不能构成碱基互补配对;③引物的5'端应该有限制酶酶切位点等。 4.引物2和引物3 引物过短,则会导致引物特异性太弱,出现非特异性扩增,非目标产物增多 [解析] 引物需要互补结合在模板链的3'端,因此利用PCR 获得 Ech基因时应选择的两种引物是引物2和引物3;引物过短,则会导致引物特异性太弱,出现非特异性扩增,非目标产物增多,故引物核苷酸序列不宜过短。 三、(1)B、C 3 30 (2)7/8 5 8 [解析] (1)已知DNA扩增时总是从子链的5'端向3'端延伸,由题图可知,5'端对应的引物分别是B和C。至少要3个循环才能分离出双链等长的目的基因片段。PCR体外扩增DNA时,每条链都需要一个引物,所以循环n次,产生2n个DNA,去除原来的模板,即需要的引物数目为(2n-1)×2。循环四次共需要的引物数目为(24-1)×2=30。(2)PCR过程与细胞内的DNA复制过程类似,复制4次后,产生的DNA总数为16,有2个DNA分子中含有原来的母链,其他的DNA都同时含有两种引物,所以同时含有两种引物的DNA占总数的14/16,即7/8。复制过程中部分DNA片段如图所示: 第一次复制得到两个、两种类型的DNA片段:①和②;第二次复制得到四个、四种类型的DNA片段:①复制得①和③、②复制得②和④;第三次复制得到八个、五种类型的DNA片段:①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤;第四次复制得到十六个、五种类型的DNA片 ... ...
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