微专题10 几种常见PCR技术的原理 1.(1)引物4和引物5 BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ 当外源DNA入侵时,原核生物利用限制酶来切割外源DNA,使之失效,以保证自身安全 (2)逆转录酶 变性 (3)易于进行大规模培养、易于进行蛋白产物的收集 [解析] (1)引物应与模板链的3'端碱基互补配对,故引物1、引物2、引物7和引物8不合适,扩增得到的RBD蛋白基因也应该含有多个限制酶的酶切位点,故引物3和引物6不合适,所以应选择引物4和引物5。质粒上没有Sma Ⅰ 酶的酶切位点,且Sma Ⅰ 酶的酶切位点位于RBD蛋白基因内部,所以不选Sma Ⅰ 进行切割;若使用EcoR Ⅰ 进行切割,易造成目的基因和质粒自身环化;所以选择的限制酶是BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ 。原核生物容易受外源DNA的入侵,所以在长期进化过程中形成了一套完善的防御机制,限制酶是原核生物的一种防御性工具,当外源DNA入侵时,原核生物利用限制酶来切割外源DNA,使之失效,以保证自身安全,防止外来病原物的危害。(2)以病毒RNA为模板合成cDNA属于逆转录过程,这一过程需要的酶是逆转录酶。PCR每次循环分为变性、复性、延伸三步,变性温度超过90 ℃,复性温度为50 ℃左右,延伸温度在72 ℃左右。(3)CHO细胞可贴壁培养、经过多次传代筛选后也可悬浮培养,属于成纤维细胞,本身很少分泌内源蛋白,由此推测制备重组疫苗的实验思路中用CHO细胞作为受体细胞的原因是该细胞易培养、易生长、易收获蛋白产物。 2.(1)②③ 2n-n-1 (2)含有定点突变的碱基并能与DNA模板链碱基互补配对 2 ② (3)5' Sma Ⅰ 和BamH Ⅰ [解析] (1)所选引物应该把编码序列全部扩增在内,则所用的引物是②③。T4溶菌酶基因的两条链分别为a、b,引物②与a链结合,引物③与b链结合。每复制一次,以a链为模板复制出一条含有引物②的新链,且复制出的含此链的DNA不符合要求,则复制n次,形成n个不符合要求的DNA,另外含b链的DNA分子有1个且不符合要求,所以复制n次后,符合要求的DNA分子有(2n-n-1)个。(2)据图乙所示,突变上游引物对应的是DNA的拟突变位点,因此进行第一次PCR时所用的突变上游引物的合理设计是含有定点突变的碱基并能与DNA模板链碱基互补配对。经过第一次PCR扩增可以获得①,下游大引物是与①互补配对的DNA单链,需要再次进行PCR扩增才能获得,所以至少需要2次循环,才能获得相应的大引物。DNA复制的方向是从模板链的3'→5',对应的下游大引物是②。(3)对T4溶菌酶基因进行PCR扩增时,是从引物的5'端到3'端延伸子链,因此限制酶识别序列应在引物的5'端。构建重组DNA分子时,需要目的基因和质粒含有相同的黏性末端,结合图丙分析,若选择EcoR Ⅰ 切割,则会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因,导致无法进行筛选,因此选择Sma Ⅰ 和BamH Ⅰ 。 3.(1)④②③⑤① 引物是根据该冠状病毒的核酸的一段已知序列设计合成的(或引物能与该冠状病毒核酸对应的cDNA特异性结合) (2)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,从而延伸DNA子链 使2个引物分别与互补的DNA单链结合,形成氢键 (3)耐高温的DNA聚合酶 5'→3' PCR产物 [解析] (2)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端延伸DNA子链,因此在体外扩增目的基因时,需要根据目的基因的核苷酸序列人工合成两种引物。PCR过程中复性的作用是使2个引物分别与互补的DNA单链结合,形成氢键。(3)根据题干信息可知,PCR反应中,耐高温的DNA聚合酶的作用是催化子链延伸,同时还具有外切酶活性,可以沿着5'→3'方向将探针酶切,报告基团分离出来后会发出荧光,随着DNA扩增次数的增加,探针中的报告基团分离增多,荧光的强度增加,荧光信号的变化与PCR产物的形成完全同步。微专题10 几种常见PCR技术的原理 1.RT-PCR技术 (1)概念:以mRNA为模板进行的特殊的PCR。 (2)步骤:逆转录→cDNA→(常规PCR)扩增目的基因(见下 ... ...
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