长句应答(六)———实验思路法”解答基因工程的原理分析 [考题例证] (2022·山东卷节选)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或P△的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或P△的功能。 (1)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是 。 修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是 。 (2)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是 ;由②④组或③⑤组的差异推测,P△中缺失的特定序列的作用是 。 [解题策略] 1.解法指导 分析基因编辑表达错误出现的原因,构建模型,提出修改思路。 2.实验思路分析 (1)融合基因时,注意事项: 找出模板链→明确转录、翻译的方向→添加引物或者限制酶→不能改变相应基因的读码序列→若有必要可以适当添加或减少碱基进行改造 (2)基因工程中的相关实验分析: 分析实验目的 ↓ 分析实验的自变量和因变量 ↓ 根据实验结果,进行实验分析 3.(1)找出模型中表示的DNA编码链→转录、翻译从左向右进行→ATG对应AUG,恰好是起始密码子(对应甲硫氨酸Met)→P基因编码链的第一个碱基“A”与EcoRⅠ识别序列最后两个碱基“TC”构成了TCA,导致后续密码子被错位读取→重新设计引物,在EcoRⅠ识别序列3′端(即识别序列之后)增添1个碱基。 (2)实验目的:探究药物A的作用 ↓ 分析自变量、因变量:自变量为①～⑤组中加入的物质不同,①组为对照组,②～⑤组为实验组 因变量为是否出现UBC的条带 ↓ 若样品中含有FLAG,它们就会被介质滞留,用抗UBC的抗体检测介质中的UBC含量,并以图丙作为实验主要结果。若要出现UBC的条带,则结合模型为UBC抗体-UBC-P(或P△)-FLAG-FLAG抗体。②组有弱阳性结果,说明FLAG-P可以实现上述过程,③组添加药物A,结果为显著阳性,最可能是增强了P与UBC的结合。④⑤组中无UBC条带,说明UBC与P△不能结合,P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列 【答案】 (1)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA上的密码子被错位读取 在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基 (2)增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 【解析】 (1)融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同,说明P基因翻译时出错。由图可看出,P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA上的密码子被错位读取,翻译出的氨基酸序列改变,可通过在引物的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基,这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变,能够正常翻译。 (2)①组仅添加UBC,处理后,用UBC抗体检测,不出现杂交带;②组添加UBC和FLAG-P,出现杂交带;③组添加UBC、药物A和FLAG-P,杂交带更加明显,说明药物A的作用是增强FLAG-P与UBC的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P,出现杂交带;④⑤组使用FLAG-P△, ... ...
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