5.2多聚酶链式反应扩增dna片段 学案 【课题目标】 本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。 【课题重点与难点】 课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。 课题难点：PCR的原理。 [导学诱思] 1．PCR原理 填写下列表格 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 合成子链的原料 DNA聚合酶 引物 DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为_____，而磷酸基团的末端称为_____ 。DNA聚合酶不能_____开始合成DNA，而只能_____，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是_____。 在DNA的复制过程中，复制的前提是_____。在体外可通过控制_____来实现。在_____的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为_____。PCR利用了DNA的_____原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来_____的DNA聚合酶的发现和应用，大大增加了PCR的效率。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供：_____，_____，_____，_____，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 2．PCR的反应过程 PCR一般要经历_____循环，每次循环可以分为_____、_____和 _____三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由 延伸而成的DNA单链会与_____结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能 _____，使这段固定长度的序列成指数扩增。 3．实验操作 在实验室中，做PCR通常使用_____，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器，按PCR反应体系的配方在_____中依次加入各组分，，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。 4．操作提示 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的_____、_____ 、 _____ 以及蒸馏水等在使用前必须进行_____。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在 _____储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反应成分时，移液管上的枪头要_____。 [疑难点拨] 1.PCR技术简介 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。 2．细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用 ①解旋酶：打开DNA双链 ②DNA母链：提供DNA复制的模板 ③4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 ④DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸） 3．DNA的合成方向 DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3，端，而磷酸基团的末端称为5，端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3，端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3，端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。 4．PCR的反应过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（当温度上升到90oC以上时，双链DNA解聚为单链）、复性（温度下降到50oC左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）和延伸（温度上升到72oC左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序 ... ...
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