6.2 DNA片段的扩增———PRC技术 ★课题目标 （一）知识与技能 1、了解PCR技术的基本操作 2、理解PCR的原理 3、讨论PCR的应用 （二）过程与方法 在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件 （三）情感、态度与价值观 通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神 ★课题重点 PCR的原理和PCR的基本操作 ★课题难点 PCR的原理 ★教学方法 启发式教学 ★教学工具 多媒体课件 ★教学过程 （一）引入新课 在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。 （二）进行新课 1．基础知识 PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似： 1．1细胞内DNA复制条件分析： 条件 组分 作用 模板 DNA的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 酶 解旋酶DNA聚合酶 打开DNA双螺旋催化合成DNA子链 能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能 引物 RNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点 1．2细胞内DNA复制过程 （1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6） 核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图） 由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。 DNA双螺旋结构的反向平行结构： （2）DNA的复制过程: 解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。 引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。 DNA聚合酶结合： 子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。 后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链） 子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。 感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。 ［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？ DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。 ［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。 1．3DNA分子复制的人工控制 解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。 恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。 反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。 ［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质） 4．PCR的反应过程 变性：在95℃时DNA解旋 复性：在50℃时引物与DNA单链结合 延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列） 2．实验操作 2．1 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水 2．2 实验操作步骤 2．3 按照PCR反应体系配方配制反应液； （2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中； （3）将微量离心管放到PCR仪中； （4）设置PCR仪的工作参数。 （5）DNA在PCR仪中大量扩增。 2．4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。 3．实验注意事项 3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。 3 ... ...
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